مستو طبقات ثنائية لدعم تشكيل لدراسة نقاط الاشتباك العصبي والمناعي Kinapse

مرحباً، أنا مايك داستن من معهد جيرال وكلية الطب بجامعة نيويورك. سأقوم اليوم بإرشادكم خلال إجراء تكوين طبقة حيوية مستوية داعمة لدراسة المشبك المناعي. لذا، دعونا نبدأ.

لصنع طبقة الدهون الثنائية، نقوم بتحضير محلول يتكون من 20% من الدهون المخلبية للنيكل و80% من الفوسفاتيديل كولين بالكميات المناسبة في أنبوب زجاجي مع واحد إلى اثنين من المليلترات من الكلوروفورم والميثانول. تتمثل الخطوة الأولى في تبخير المذيب تحت تيار من غاز النيتروجين في حمام مائي دافئ تتراوح درجة حرارته بين 30 إلى 37 درجة مئوية. وتستغرق هذه العملية عادةً حوالي 15 دقيقة.

ثم قم بإزالة أي مذيب متبقٍ تحت تفريغ عالٍ باستخدام جهاز التجفيف بالتجميد لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك، أذب الدهون في محلول منظم ملحي يحتوي على منظف octal glucocide بنسبة 2%N للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.4 millimolar. يؤدي ذلك إلى تكوين محلول من الميسيلات المختلطة من المنظفات والدهون الفسفورية لتكوين الليبوزومات.

تُجرى عملية ديالزة لهذا المحلول مقابل ثلاثة تغييرات من محلول tris saline لإزالة المنظف وتكوين الليبوزومات. عادةً ما نتعامل مع أحجام في حدود واحد ملليلتر باستخدام أنابيب بقطر ستة مليمتر وبحد قطع يبلغ حوالي 10 kilodaltons، مع الحرص على استبعاد أي فقاعات هواء أثناء تثبيت الأنابيب. نقوم بترشيح هذا المحلول تعقيمياً وإجراء عملية الديالزة تحت ظروف نظيفة، مع التعامل معه باستخدام قفازات معقمة بـ 70%ethanol.

يجب أن يكون هذا المحلول رائقاً تماماً، ويُحفظ تحت غاز الأرجون لمنع الأكسدة. إذا كان المحلول عكراً، فهذا يعني أنك قد كوّنت حويصلات متعددة الجدران، وبالتالي يجب البدء من جديد. ولإعداد التجربة، نحتاج أولاً إلى تحديد كمية ICAM one وMHC المترسبة على مساحة سطح معينة من الطبقة الثنائية المخلبية للنيكل عند تركيز معين من البروتين الذائب.

للقيام بذلك، نقوم بترسيب طبقات ثنائية على خرزات زجاجية بقطر خمسة ميكرومتر. يتم تحضين الخرزات الزجاجية مع محاليل بروتينية تحت ظروف تقارب تلك المستخدمة في خلايا التدفق المخصصة للتصوير، ثم يتم قياس كثافة البروتين المرتبط عن طريق مقايسة الفلورومتر المناعية للتدفق. تُستخدم أجسام مضادة موسومة بـ FSI بأعداد معروفة من الفلوريسين لكل جزيء للكشف عن البروتينات المرتبطة بالسطح، كما تُستخدم خرزات الفلوريسين القياسية لمعايرة الميكروفلورومتر الخاص بالتدفق.

سنقوم بإنشاء ظروف تحاكي تلك الموجودة في الخلايا المقدمة للمستضد، بحيث تحتوي على 200 جزيء لكل ميكرومتر مربع من ICAM one و0.2 إلى 20 جزيء لكل ميكرومتر مربع من I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. تتشكل الطبقات الثنائية المستوية المعقدة تلقائياً عندما تندمج الليبوزومات مع الزجاج، ولكن يحدث ذلك فقط إذا كان الزجاج نظيفاً بشكل صحيح. ونحن نستخدم محلول Piranha الحمضي، وهو خليط محضر حديثاً من حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين بتركيز 30%، والذي يعمل على تدمير جميع المواد العضوية كما يجعل سطح الزجاج محباً للماء للغاية.

عند العمل بمحلول البيرانا، نرتدي ملابس واقية كاملة، بما في ذلك مئزر واقٍ من الأحماض وقفازات سميكة مقاومة للأحماض. يجب فصل النفايات بعناية عن النفايات العضوية والتخلص منها بشكل صحيح. ولتحضير محلول حمض البيرانا، أضف 75 milliliters من حمض الكبريتيك المركز إلى دورق جاف، ثم أضف بعناية 25 milliliters من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30%.

يسخن المحلول بسرعة حتى يتجاوز 100 °C، ثم تُغمر شرائح التغطية الجافة في المحلول لمدة 15 دقيقة. وبعد هذا التحضين في محلول piranha، تُغمس شرائح التغطية في ماء منقى ثم تُشطف لمدة دقيقة واحدة لكل جانب. بعد ذلك، تُجفف شرائح التغطية باستخدام مصدر تفريغ للتخلص من الماء المنقى.

اترك محلول البيرانا ليبرد ثم أضفه إلى حاوية نفايات البيرانا، والتي تُترك بغطاء غير محكم الإغلاق ومميزة بوضوح داخل خزانة استخلاص الغازات لتشكيل الطبقات الثنائية. يستخدم مختبرنا نظام bi FCS two ذو الغرفتين، والذي يتميز بتوفير خاصية التسخين المدمجة. يرتكز نظام FCS two على قاعدة من الفولاذ المقاوم للصدأ التي تثبت معاً مجمعاً للموائع الدقيقة مع حشية علوية بسماكة 0.5 millimeter، وشريحة قناة مائية دقيقة مطلية بأكسيد القصدير والإنديوم للتسخين على أحد السطحين وبها أخدود للموائع على الجانب الآخر.

حشية خالية من الغبار بمقاس 0.25 مليمتر تحدد ارتفاع غرفة التدفق، وشريحة غطاء مستديرة بمقاس 40 مليمتر منظفة بمحلول البيرانا يتم تشكيل الطبقة الثنائية عليها لتجميع خلية التدفق وتكوين طبقات ثنائية مستوية. ضع الموزع بحيث تكون الأنابيب موجهة للأعلى على سطح مستوٍ. ثم ضع الحشية بمقاس 0.5 مليمتر مع وضع الثقوب فوق أنابيب السوائل وتأكد من استقرارها بشكل مسطح.

ضع شريحة القناة الدقيقة برفق بحيث تكون القنوات المائعية موجهة للأعلى، وتأكد من استقرارها بشكل مسطح دون تطبيق أي ضغط للأسفل حتى يتم التحقق من محاذاة الثقوب الموجودة في الشريحة مع الأنابيب المائعية الدقيقة. بعد ذلك، ضع الحشية الخالية من الغبار بسمك 0.25 millimeter ذات الفتحة المستطيلة فوق شريحة القناة الدقيقة، بحيث تكون القناة محاذية للقنوات المائعية مع ضمان عدم وجود فراغات هوائية كبيرة. ضع ما يصل إلى خمس قطرات بحجم 1 µL من معلق الليبوزومات على سطح شريحة القناة الدقيقة بنمط تكون فيه المسافة من المركز إلى المركز بين كل قطرة 2.5 millimeter. قد تختلف تركيبات قطرات الليبوزومات الخمس، ولكن في هذه الحالة، سنقوم بتكوين طبقتين ثنائيتين فقط، واحدة بدون ليبيدات مخلبية للنيكل، وأخرى تحتوي على 10% ليبيدات مخلبية للنيكل.

بمجرد وضع هذه القطرات، ضع غطاء الشريحة بعناية على السطح بحركة واحدة، ثم قم بتثبيته على القاعدة بأسرع ما يمكن. يجب أن تتلامس قطرات الليبوزوم مع غطاء الشريحة. يجب عدم قطع هذا التلامس لأن الطبقات الثنائية تكون قد تشكلت على الأرجح، وأي اضطرابات قد تؤدي إلى تكوين طبقات ثنائية معيبة.

في هذه المرحلة، من المهم تذكر تحديد مواضع الطبقات الثنائية بوضع بضع نقاط صغيرة من الحبر على الشريحة للمساعدة في تموضع غطاء الشريحة على المجهر. انتظر لمدة 20 دقيقة للتأكد من وصول النظام إلى حالة التوازن، ثم انقل جميع المحاليل باستخدام سرنجة سعة 20 milliliter متصلة بحوالي 20 centimeters من الأنابيب المرنة وصمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات. يتم بعد ذلك توصيل المنفذ الآخر لصمام الإيقاف بخلية التدفق عن طريق قطعة قصيرة من الأنابيب لتقليل الحجم الميت بين صمام الإيقاف وخلية التدفق.

املأ المحقنة بمحلول ملحي منظم من نوع heis يحتوي على كلوريد المغنيسيوم، وكلوريد الكالسيوم، والجلوكوز، وألبومين المصل البشري. قم بتجهيز الأنابيب والصمام ثلاثي الاتجاهات لضمان خلوهما من فقاعات الهواء. بعد ذلك، قم بتوصيل المحقنة بخلايا التدفق وادفع خمسة ملليلترات 5 mL بحركة واحدة مع المراقبة للتأكد من عدم مرور أي فقاعات هواء فوق الطبقة الثنائية.

الآن، ستكون الطبقات الثنائية جاهزة لإدخال البروتينات ذات وسم His إلى الطبقة الثنائية. يجب أولاً حجبها باستخدام الكازين وشحنها بالنيكل. املأ سرنجة سعة 1 mL بمحلول أيونات النيكل والكازين، ثم قم بتوصيلها بالمنفذ الجانبي مع الحرص على عدم حبس أي فقاعات هوائية.

بعد حقن المحلول، انتظر لمدة 20 دقيقة للسماح بعملية الحجب الكاملة. ثم قم بغسل محلول الحجب باستخدام H-B-S-H-S-A من المحقنة سعة 20 milliliter. الآن احقن 0.5 milliliters من محلول H-B-S-H-S-A الذي يحتوي على ICAM one المسمى بـ polyhis وIEK.

في هذه التجربة، يتم وسم ICAM one باستخدام SCI five. وبذلك، يمكن تتبع تفاعلات LFA one وICAM one من خلال تصوير إعادة ترتيب ICAM one في الطبقة الثنائية؛ اترك البروتين لمدة 30 دقيقة ليرتبط بالطبقة الثنائية المشحونة بالنيكل أثناء التصاق البروتين بالطبقة الثنائية. ثبّت خلية التدفق بالمجهر المقلوب باستخدام قطعة إدخال مخصصة للمنصة.

بعد ذلك، قم بتوصيل الإلكترونيات الخاصة بالتسخين للسماح للنظام بالوصول إلى حالة التوازن عند 37 درجة مئوية. استخدم العلامات التي تم وضعها مسبقاً لضبط موضع خلية التدفق بحيث تكون العدسة الشيئية محاذية لإحدى الطبقات الثنائية، واستخدم مجهر الانعكاس التداخلي لتحديد المستوى البؤري عن طريق التركيز على صورة الضوء المنعكس للحجاب الميداني. وأخيراً، قم بغسل بروتين ICAM one غير المرتبط من خلايا التدفق.

التقط صور الفلورة للطبقة المزدوجة في قناة ICAM one بنمطي turf M وwidefield. يهدف ذلك إلى تأكيد ارتباط ICAM one بالطبقة المزدوجة المطلية بالنيكل مقارنة بالطبقة المزدوجة الخالية من النيكل. الآن أصبحت خلية التدفق جاهزة لاستقبال الخلايا.

في هذا العرض التوضيحي، سنستخدم خلايا T عابرة للجينات لمستقبل الخلايا التائية ND T-cell receptor تم تحويلها بواسطة فيروس ريتروفيروسي ENC يغلف GFPs P zap 70، نقوم بغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام H-B-S-H-S-A ثم نحضن الخلايا مع FAB مُوسوم بـ Alexa 5 68 وموجه ضد مستقبل الخلايا التائية حتى نتمكن من تتبع العناقيد الدقيقة لـ TCR. بعد 15 دقيقة، يتم تخفيف الخلايا بنسبة 1 إلى 10. يؤدي ذلك إلى تخفيف الجسم المضاد H 57 بما يكفي لضمان عدم تداخله مع تصوير turf M، مع الحفاظ على تشبع مستقبل الخلايا التائية بينما يبدأ الـ fab المرتبط في البداية بالانفصال، ثم يتم حقنها في خلية التدفق.

نقوم بتصوير التشابك المناعي باستخدام وضع M ثلاثي الألوان. يشمل ذلك تكوين تفاعل LFA-1 وICAM-1، وتكوين تجمعات TCR ومنطقة cSMAC، والتكوين المستمر لتجمعات TCR الدقيقة التي تجذب GFP-ZAP-70. تكون بعض هذه النتائج واضحة أثناء عملية الحصول على الصور، بينما تتطلب نتائج أخرى تحليلاً في مرحلة ما بعد المعالجة لتقديرها بشكل كامل.

حسنًا، لقد شرحنا لكم للتو كيفية استخدام الطبقات الثنائية المستوية المدعومة لدراسة المشبك المناعي. من المهم جدًا لنجاح هذه التجارب أن تكون الخلايا التائية في حالة جيدة جدًا، علماً بأن محلول PPS الملحي المنظم غير مناسب لزراعة الخلايا التائية على المدى الطويل. لذا، يجب إخراج الخلايا من المزرعة، ووضعها في هذا الوسط، ثم استخدامها بسرعة كبيرة.

إذا وجدت أنك ترغب في إجراء تجارب طويلة المدى، فهناك بعض تركيبات الأوساط الخالية من المصل الجيدة جداً والتي يمكنك استخدامها كبديل للمحلول الملحي الملح الموقّت بالفوسفات. سيحافظ ذلك على حيوية الخلايا لفترة أطول بكثير إذا كنت ترغب في دراسة نقاط نهاية طويلة المدى، مثل إنتاج السيتوكينات أو تكاثر الخلايا التائية. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.