مستو طبقات ثنائية لدعم تشكيل لدراسة نقاط الاشتباك العصبي والمناعي Kinapse

مرحبا ، أنا مايك داستن من معهد جيرال وكلية الطب بجامعة نيويورك. سآخذك اليوم خلال إجراء تكوين بيولاي مستو داعم لدراسة المشبك المناعي. لذلك دعونا نبدأ.

لصنع طبقة ثنائية الدهون ، نقوم بإعداد محلول من 20٪ نيكل ، ودهون مخلبية ، و 80٪ فوسفاتيديل كولين بالكميات المناسبة في أنبوب زجاجي مع واحد إلى ملليلتر من ميثانول الكلوروفورم. تتمثل الخطوة الأولى في تبخير المذيب تحت تيار من غاز النيتروجين في حمام مائي دافئ من 30 إلى 37 درجة مئوية. يستغرق هذا عادة حوالي 15 دقيقة.

ثم قم بإزالة أي مذيب متبقي تحت فراغ عالي باستخدام مجمل التجفيد لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإذابة الدهون في محلول ملحي من منظف الجلوكوسيد ثماني النيوتروجين بنسبة 2٪ إلى تركيز نهائي يبلغ 0.4 ملليمول. هذا يخلق محلولا من خلايا الفوسفوليبيد المختلطة المنظفات لتشكيل الجسيمات الشحمية.

تقوم بغسيل هذا المحلول بالكلى مقابل ثلاثة تغييرات من محلول ملحي لإزالة المنظفات وتشكيل الجسيمات الشحمية. عادة ما نعمل بأحجام بترتيب مليلتر واحد بقطر ستة ملليمترات مع قطع حوالي 10 كيلودلتون ونحرص على استبعاد أي فقاعات هواء أثناء تثبيت الأنبوب. نقوم بتصفية هذا المحلول المعقم ونقوم بغسيل الكلى في ظروف نظيفة والتعامل معه باستخدام قفازات معقمة بالإيثانول بنسبة 70٪.

يجب أن يكون هذا المحلول واضحا تماما ويتم تخزينه تحت غاز الأرجون لمنع الأكسدة. إذا كان الحل عكرا ، فقد قمت بإنشاء حويصلات متعددة الجدران وتحتاج إلى البدء من جديد. من أجل تحديد التجربة ، نحتاج أولا إلى تحديد مقدار ICAM واحد و معقد التوافق النسيجي الكبير المودعين على مساحة سطح معينة من طبقة مخلب النيكل الثنائية بتركيز معين من البروتين القابل للذوبان.

للقيام بذلك ، نقوم بإيداع طبقات ثنائية على سرعات زجاجية بقطر خمسة ميكرومترات. احتضان الخرزات الزجاجية بمحاليل البروتين في ظل ظروف تقارب تلك الموجودة في خلايا التدفق المستخدمة في التصوير ، ثم اقرأ كثافة البروتين المرتبط بواسطة مقايسة مترية مناعية للتدفق. تستخدم الأجسام المضادة المسماة FSI بأعداد معروفة من الفلورسين لكل جزيء للكشف عن البروتينات المرتبطة بالسطح وتستخدم حبيبات الفلورسين القياسية لمعايرة مقياس الفلور الدقيق للتدفق.

سنضع شروطا تقارب تلك الموجودة على الخلايا العارضة للمستضد مع 200 جزيء لكل ميكرومتر مربع من ICAM واحد و 0.2 إلى 20 جزيئا لكل مربع. ميكرومتر من I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 ، تتشكل الطبقات الثنائية المستوية المعقدة تلقائيا عندما تندمج الجسيمات الشحمية مع الزجاج ، ولكن فقط إذا تم تنظيفها بشكل صحيح لتنظيف الزجاج. نستخدم محلول البيانا الحمضي ، وهو خليط طازج من حمض الكبريتيك و 30٪ بيروكسيد الهيدروجين ، والذي يدمر جميع المواد العضوية ويترك السطح الزجاجي شديد الماء.

عند العمل مع سمكة البيرانا ، نرتدي ملابس واقية كاملة ، بما في ذلك ساحة حمضية وقفازات مقاومة للأحماض الثقيلة. يجب فصل النفايات بعناية عن النفايات العضوية والتخلص منها بشكل صحيح. لتحضير محلول سمكة البيرانا الحمضية ، أضف 75 مل من حمض الكبريتيك المركز إلى دورق جاف ثم أضف بعناية 25 مل من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪.

يسخن المحلول بسرعة حتى أكثر من 100 درجة مئوية ، ثم يغمر زلات الغطاء الجاف في المحلول لمدة 15 دقيقة. بعد هذه الحضانة في سمكة البيرانا ، اغمس الغطاء في ماء نقي ثم اشطفه لمدة دقيقة على كل جانب. ثم جفف زلات الغطاء باستخدام مصدر تفريغ لتصريف المياه النقية.

اترك محلول سمكة البيرانا يبرد وأضفه إلى حاوية نفايات سمكة البيرانا ، والتي تترك بغطاء فضفاض ، ومميز جيدا في غطاء الدخان لتشكيل الطبقات الثنائية. يستخدم مختبرنا غرفتين من ثنائي FCS ، والتي تتمتع بمزايا التدفئة المتكاملة. يوجد نظام FCS الثنائي على قاعدة من الفولاذ المقاوم للصدأ تربط معا مشعب الموائع الدقيقة مع حشية علوية 0.5 ملم ، وشريحة قناة صغيرة مطلية بأكسيد قصدير الإنديوم للتسخين على سطح واحد وأخدود سائل على الجانب الآخر.

حشية خالية من الغبار 0.25 ملم تحدد ارتفاع غرفة التدفق وتنظيف أسماك البيرانا انزلاق غطاء دائري مقاس 40 ملم تتشكل عليه الطبقة الثنائية لتجميع خلية التدفق وتشكيل طبقات ثنائية مستوية. ضع المشعب مع توجيه الأنابيب لأعلى على سطح مستو. ثم ضع الحشية 0.5 ملم مع وجود ثقوب فوق الأنابيب السائلة وتأكد من وضعها بشكل مسطح.

ضع شريحة القناة الصغيرة برفق بحيث تكون القنوات السائلة متجهة لأعلى وتأكد من أنها مسطحة دون تطبيق أي ضغط لأسفل حتى تتحقق من أن الثقوب الموجودة في الشريحة تحاذي أنابيب الموائع الدقيقة. ثم ضع حشية 0.25 ملم خالية من الغبار مع فتحة مستطيلة أعلى شريحة القناة الصغيرة بحيث تصطف القناة مع القنوات السائلة ولا توجد مساحات هوائية رئيسية ، ضع ما يصل إلى خمس قطرات ميكرولتر من تعليق الجسيمات الشحمية على سطح شريحة القناة الدقيقة في نمط بحيث تكون المسافة من المركز إلى المركز بين كل قطرة 2.5 ملم. قد يكون لقطرات الجسيمات الشحمية الخمس تركيبات مختلفة ، ولكن في هذه الحالة سنشكل طبقتين فقط ، واحدة لا تحتوي على دهون مخلبية من النيكل ، والأخرى تحتوي على دهون مخلبية من النيكل بنسبة 10٪.

بمجرد وضع هذه القطرات في مكانها ، ضع الغطاء بعناية على السطح بحركة واحدة ، وقم بتثبيته على القاعدة في أسرع وقت ممكن. يجب أن تتلامس قطرات الجسيمات الشحمية مع زلة الغطاء. لا ينبغي كسر هذا الاتصال لأن الطبقات الثنائية ربما تكون قد تشكلت بالفعل وقد تؤدي أي اضطرابات إلى خلل في طبقات مزدوجة.

في هذه المرحلة ، من المهم أن تتذكر تحديد مواضع الطبقات الثنائية ببعض بقع الحبر الصغيرة على الشريحة للمساعدة في وضع زلة الغطاء على المجهر. انتظر 20 دقيقة للتأكد من أن النظام قد تم نقل جميع الحلول بشكل متوازن باستخدام حقنة 20 ملليلتر متصلة بحوالي 20 سم من الأنابيب المرنة وقضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات. ثم يتم توصيل منفذ آخر من قضيب التوقف بخلية التدفق بطول قصير من الأنابيب لتقليل الحجم الميت بين محبس وخلية التدفق.

املأ المحقنة بمحلول ملحي يحتوي على كلوريد المغنيسيوم وجلوكوز كلوريد الكالسيوم وألبومين المصل البشري. قم بتجهيز الأنبوب وإيقاف الديك حتى لا تكون هناك فقاعات هواء. ثم قم بتوصيل هذا بخلايا التدفق وادفع خمسة ملليلتر بحركة واحدة أثناء المشاهدة للتأكد من عدم مرور فقاعات الهواء فوق الطبقة الثنائية.

الآن سيكون لديك طبقات ثنائية لإدخال البروتينات ذات العلامات الهسهسة في الطبقة الثنائية. يجب أولا حظره بالعلبة وشحنه بالنيكل. املأ حقنة سعة مليلتر واحد بمحلول أيون النيكل العلبة وقم بتوصيلها بالمنفذ الجانبي دون حبس أي فقاعات هواء.

بعد حقن المحلول ، انتظر 20 دقيقة للسماح بالحجب الكامل. ثم اغسل محلول الحظر باستخدام H-B-S-H-S-A من المحقنة سعة 20 مل. الآن حقن 0.5 ملليلتر من محلول H-B-S-H-S-A الذي يحتوي على polyhis الموسومة ICAM one و IEK.

في هذه التجربة ، تم تصنيف ICAM ب SCI خمسة. لذلك يمكن أن يتبع تفاعلات LFA one ICAM واحدة عن طريق تصوير إعادة ترتيب ICAM في الطبقة الثنائية ، مما يسمح ب 30 دقيقة للبروتين لربط الطبقة الثنائية المشحونة بالنيكل بينما يلتصق البروتين بالطبقة الثنائية. قم بتأمين خلية التدفق في المجهر المقلوب باستخدام إدراج مرحلة مخصصة.

ثم قم بتوصيل إلكترونيات التدفئة للسماح للنظام بالتوازن عند 37 درجة مئوية. استخدم العلامات التي تم إجراؤها سابقا لوضع خلية التدفق بحيث يتم محاذاة الهدف مع إحدى الطبقات الثنائية واستخدم الفحص المجهري لانعكاس التداخل لتحديد موقع المستوى البؤري من خلال التركيز على صورة الضوء المنعكسة لغشاء المجال. أخيرا ، اغسل ICAM غير المرتبط من خلايا التدفق.

احصل على صور مضان للطبقة الثنائية في ICAM قناة واحدة في العشب M وأوضاع المجال العريض. هذا لتأكيد ربط ICAM واحد على الطبقة الثنائية المطلية بالنيكل بالنسبة للطبقة الثنائية الخالية من النيكل. خلية التدفق جاهزة الآن لاستقبال الخلايا.

في هذا العرض التوضيحي ، سنستخدم الخلايا التائية المعدلة وراثيا لمستقبلات الخلايا التائية ND التي تم تحويلها بطلاء ENC للفيروسات القهقرية GFPs P zap 70 ، وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام H-B-S-H-S-A ثم احتضان الخلايا باستخدام Alexa 5 68 المسمى FAB إلى مستقبلات الخلايا التائية حتى نتمكن من تتبع مجموعات TCR الصغيرة. بعد 15 دقيقة ، قم بتخفيف الخلايا من واحد إلى 10. يؤدي هذا إلى تخفيف الجسم المضاد H 57 بدرجة كافية بحيث لا يتداخل مع تصوير العشب M ، ولكنه يحافظ على تشبع مستقبلات الخلايا التائية حيث يبدأ المصباح المرتبط في البداية في الانفصال ، ثم حقنها في خلية التدفق.

نصور المشبك المناعي في وضع M بثلاثة ألوان. ويشمل ذلك تشكيل تفاعل LFA واحد ، وتفاعل ICAM واحد ، وتشكيل مجموعات TCR و C smac والتكوين المستمر لمجموعات TCR الصغيرة ، التي توظف GFP ZAP 70. بعض هذه النتائج واضحة أثناء الاستحواذ ، في حين أن البعض الآخر سيتطلب تحليلا بعد المعالجة لتقديره بالكامل.

حسنا ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية استخدام الطبقات الثنائية المستوية المدعومة لدراسة المشبك المناعي. من المهم جدا أن تعمل هذه التجارب على أن تكون الخلايا التائية في حالة جيدة جدا وأن المحلول الملحي المخزن PPS ليس مناسبا لزراعة الخلايا التائية على المدى الطويل. لذلك تريد إخراج الخلايا من المزرعة ، ووضعها في هذه الوسائط ، ثم استخدامها بسرعة كبيرة.

إذا وجدت أنك ترغب في إجراء تجارب طويلة المدى ، فهناك بعض تركيبات الوسائط الخالية من المصل الجيدة جدا والتي يمكنك استبدالها بالمحلول الملحي المخزن مؤقتا. سيبقي ذلك الخلايا على قيد الحياة لفترة أطول إذا كنت ترغب في القيام بنقطة نهاية أطول ، مثل إنتاج السيتوكين أو تكاثر الخلايا التائية. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.