Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
DNA 是所有生物体的遗传分子，这一发现带来了巨大的科学和医学突破，并显着增强了我们对自身和其他生物体的理解。DNA 分离和分析是上个世纪许多进步的基本第一步;从基因功能的鉴定到农业和法医学的革命。
DNA 分离是一个相当简单的程序，只需要几个但必不可少的步骤:细胞收获、裂解、蛋白质降解，最后是 DNA 沉淀。通常，可以从少量组织中收集 DNA，例如植物的单片叶子、动物的毛囊或上皮细胞，这些细胞可以很容易地用简单的盐水溶液在口腔内脱落。由于 DNA 在真核细胞内的细胞核或线粒体内被分隔开，科学家首先打破细胞和核膜以暴露 DNA，这是通过裂解步骤完成的。然而，一旦 DNA 暴露，它就会被重金属离子和极端的 pH 值降解。因此，含有去污剂的缓冲溶液不仅可以溶解细胞膜，还可以保护 DNA 免受溶液中元素的降解。此外，DNA 是一种异常长的分子，通过紧密堆积在称为组蛋白的特殊蛋白质周围而浓缩在细胞核内。因此，添加了一种称为蛋白酶 K 的酶，它可以降解蛋白质的肽键，以将 DNA 与组蛋白和其他蛋白质分离。接下来，科学家利用其化学特性将 DNA 与细胞提取物的其余部分分离。由于核酸的带负电荷的结构，氯化钠溶液中的 Na+ 离子与缠结的 DNA 链结合并整合到其中。一旦 DNA 结块，就可以用肉眼观察到。DNA 不溶于酒精，在低温下容易沉淀，因此科学家添加冷醇来沉淀 DNA。最后，沉淀的 DNA 可以溶解并储存在去离子水或温和的缓冲液中，不含任何可降解核酸的酶，直到使用。
使用 DNA 的反应通常需要高纯度和精确量的 DNA。因此，在 DNA 分离后，科学家使用分光光度计来定量样品中 DNA 的量，以及样品中 DNA 的纯度。分光光度计测量穿过样品的光束强度与其波长的关系。核酸吸收 260 nm 的光，而蛋白质吸收 280 nm 的光。通过测量 260 nm 光束的强度，科学家可以确定 DNA 浓度。此外，通过评估 260 nm 和 280 nm 处的光强度，可以确定 DNA 含量的纯度。在纯 DNA 样品中，260/280 nm 比率应接近 2。
对于许多分析，例如克隆、测序和绘制 DNA 片段和基因组图谱，需要使用限制性内切酶在特定序列处切割分离的 DNA。这些酶由细菌产生，是针对入侵病毒 DNA 的先天免疫机制，起到分子剪刀的作用。因此，在限制性内切酶识别出病毒 DNA 后，它们开始通过将其切割成它们识别的某些核苷酸序列的片段来将其分解。这些核苷酸序列通常有 6 到 12 个核苷酸长，通常是回文的，这意味着它们在 3'-5' 和 5'-3' 方向上具有相同的核苷酸序列。例如，限制性内切酶 EcoRI 在序列 3'...GAATTC...-5'，在 5'-3' 方向上的读数相同。与 EcoRI 一样，有数百种酶对应于许多不同的回文序列。一旦 DNA 被这些酶切割，科学家就可以将 DNA 加载到电泳室中的凝胶上，并通过凝胶传递电流。DNA 带有负电荷，导致 DNA 片段向阳极迁移。然而，相对于较小的 DNA 序列，凝胶的孔会减慢较大的 DNA 片段的速度，因此这些片段根据其大小分离。电泳完成后，可以借助与 DNA 分子特异性结合的染料观察 DNA 片段。
使用限制性内切酶切割 DNA 并通过电泳分离 DNA 片段，使研究人员能够识别未知片段相对于标准分子量标准的大小。然后可以进一步分离这些目标片段并将其连接到质粒载体中以进行基因克隆。这些方法极大地改进了基因工程和实验室分析。通过 DNA 分析，科学家能够对基因组进行测序以进一步了解生物体的工作原理，并且还能够识别和表征某些基因1。
DNA 分离和分析对于直接影响日常生活的事件也很实用。例如，法医科学家通常会分析 DNA 样本，以便为刑事和民事案件提供证据2。同样，医护人员提取和分析 DNA 以检查亲子关系和遗传疾病。最近，DNA 血统分析试剂盒开始流行起来，它允许用户确定他们的遗传谱系、寻找亲属，甚至发现他们对各种健康状况的遗传倾向3。最后，随着生物技术和基因工程的进步，个性化医疗在临床研究人员中越来越受欢迎，通过使用个人的基因数据来开发治疗方法，为有效治疗患者而没有有害副作用铺平了道路4。
DNA 提取是从细胞中去除和纯化 DNA。首先，细胞被裂解 - 破裂 - 通常是通过物理破坏和化学品处理的组合，例如溶解细胞和核膜的洗涤剂。SDS 或十二烷基硫酸钠是一种常用的去污剂，其作用是溶解构成这些膜的蛋白质和脂质。然后内容物可以自由漂浮到周围的溶液中。
接下来，必须将 DNA 与存在的其他分子分离。添加到反应中的蛋白酶 K 会分解肽键并消化污染的蛋白质。然后将盐添加到样品中，以稳定 DNA 骨架中带负电荷的磷酸基团，并在加入冰冷的酒精后，将 DNA 从溶液中沉淀出来。通过在离心机中旋转收集白色沉淀物，使其沉降到试管底部。在缓冲溶液中洗涤并重悬后，提取的 DNA 最终可用于研究或生物技术应用。
一些生物技术应用，如 DNA 指纹图谱，可以识别一个或多个个体特有的 DNA 中的新模式，涉及限制性内切酶的使用。限制性内切酶是与 DNA 相互作用并识别特定序列的分子。一旦确定了它们的特定部位，他们就会切割 DNA。这将导致发束被切割成一个或多个线性块。如果提取的 DNA 是质粒，即细菌中最常见的环状 DNA 片段，则任何切割都会导致 DNA 形成线性片段或片段。不同的限制性内切酶识别不同的 DNA 序列，因此使用它们的组合可以产生不同的片段。
在 DNA 指纹图谱中，我们可以使用一种称为 DNA 或凝胶电泳的技术来检查这些片段。为了制备凝胶，将琼脂糖粉与缓冲液混合并加热直至溶解。然后将核苷酸染色剂添加到温热的混合物中，然后将该溶液倒入铸模中。插入梳子以形成孔。凝固后，将凝胶转移至装满缓冲液的凝胶盒中，并取出凝胶梳。将已知长度的染色 DNA 片段的参比混合物 DNA 分子量标准品加入一个孔中，并将染色的目标 DNA 样品上样到其余孔中。盒子连接到电源，打开电源会诱导 DNA 核苷酸中带负电荷的磷酸基团通过凝胶向阳极（正端）迁移。较小的碎片比较大的碎片移动得更快，而较大的碎片则很难迁移。
电泳完成后，将凝胶暴露在紫外光下，以观察 DNA 样品中的核苷酸染色。可以根据它们与梯形带的相对位置来确认它们的存在。由于具有不同序列的 DNA 在不同位置具有切割位点，因此可以产生新的条带模式或指纹，可用于区分个体或变体 DNA 图谱。
在本实验中，您将使用含和不含 SDS 的缓冲液进行 DNA 提取，以评估去污剂在 DNA 分离中的重要性，然后使用不同的限制性内切酶消化质粒 DNA，以检查所得的 DNA 谱。
