缓冲液
来源：美国马里兰州约翰斯·霍普金斯大学 Smaa Koraym
- 配制 50 mM NaH2PO4 缓冲液，pH 7
在本实验的第一部分，你将配制 pH 7.0 的磷酸钠缓冲溶液。磷酸二氢钠是一种弱酸，其共轭碱为磷酸氢二钠。未调节的磷酸二氢钠溶液通常 pH 值约为 4 – 6。
缓冲液在其pKa值附近时效果最佳，而磷酸二氢钠的pKa值为6.8至7.2。因此，你将使用NaOH推动平衡向共轭碱方向移动，而不改变缓冲体系的整体组成。
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实验开始前，计算配制 200 mL 50 mM 磷酸二氢钠溶液所需的磷酸二氢钠质量。
表1：50 mM NaH的制备2PO4 缓冲液，pH 7.0
点击此处下载表1NaH 的摩尔质量2PO4 = 119.98 g/mol 溶液体积（mL） 200 摩尔浓度（mM） 50 NaH的摩尔数2PO4 （摩尔） 所需质量（mg） 1 M NaOH 的初始体积（mL） 1 M NaOH 的终体积（mL） NaOH 使用体积 (mL) 所需去离子水体积（mL） -
首先，穿戴必要的个人防护装备，包括实验服、防溅护目镜和手套。 注意： 本实验部分使用具有腐蚀性和毒性的氢氧化钠（NaOH）。倾倒和转移氢氧化钠时应格外小心。
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用去离子水填充一个250 mL的塑料洗瓶。
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标记两个100 mL烧杯，分别用于盛放中性废液和碱性废液。
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使用提供的缓冲液校准pH计。使用完毕后，将探头保存在储存液中。
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去皮称量纸，使用洁净的药匙根据计算结果称取所需量的磷酸二氢钠。在实验记录本中记录磷酸二氢钠的准确质量。 注意： 磷酸二氢钠会吸收空气中的水分，因此称量时应迅速操作以获得准确读数，并在使用后立即 tightly 盖紧容器。
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将磷酸二氢钠放入400 mL烧杯中，并用实验室擦拭纸清洁药匙。在返回通风橱前，丢弃称量纸和实验室擦拭纸。
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使用量筒量取 175 mL 去离子水。将水倒入盛有磷酸二氢钠的烧杯中，并加入一个磁力搅拌子。
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搅拌溶液直至盐完全溶解，溶液呈现均一状态。此过程通常需要 2 - 3 分钟。
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量取15 mL去离子水，倒入烧杯中。继续搅拌溶液，直至其再次呈现均匀状态（约1–2分钟）。关闭搅拌电机。
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用去离子水冲洗 pH 探头，然后将其固定在溶液中，使传感器位于搅拌子上方。
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取一个10 mL量筒和表面皿至分液通风橱中，量取10 mL 1 M NaOH。记录量筒中的精确体积。
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用表面皿盖住氢氧化钠，并小心将其移至通风橱中。
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继续搅拌磷酸二氢钠溶液。在监测pH值的同时，使用一次性移液管将NaOH逐滴缓慢加入正在搅拌的溶液中。当缓冲液pH达到7.0时，将移液管中剩余的NaOH返回至量筒中。
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计算加入缓冲液的 NaOH 体积。从 10 mL 中减去该体积，以确定为使溶液总体积达到 200 mL 所需向缓冲液中加入的去离子水量。
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使用另一支10 mL量筒量取去离子水，并将其加入正在搅拌的溶液中，以完成缓冲液的配制。
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用去离子水冲洗 pH 传感器，盖上装有保存液的保护帽，然后拔掉探头插头或关闭探头电源。
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标记一个250 mL聚乙烯瓶，注明“50 mM 磷酸二氢钠缓冲液，pH 7.0”。从溶液中取出磁力搅拌子。
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使用漏斗将缓冲液倒入已标记的瓶子中，并盖紧瓶盖。
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- 中性红游离态与结合态的吸收光谱分析
缓冲液可用于在特定pH值下评估化合物。在本部分中，您将记录中性红指示剂在不同缓冲液中的吸收光谱。中性红的质子化形式呈红色，去质子化形式呈黄橙色，这意味着它们分别吸收绿光和蓝紫光。因此，酸性和碱性形式具有不同的吸收波长。蛋白质结合会改变中性红的性质，同时影响其吸光度和pKa值。
在测定游离中性红在不同 pH 值下的吸收光谱后，您将向溶液中加入核黄素结合蛋白（riboflavin-binding protein，RP），并再次测量吸光度。吸光度强度与浓度相关，因此实验结束后，您将利用这些光谱数据确定游离态和结合态中性红的 pKa 值。
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在实验记录本中绘制下表。将比色皿编号为1至10，并列出将使用的九种缓冲液pH值。第10号比色皿用于去离子水空白对照。 注意： 始终用手握住比色皿的磨砂侧面，并在将比色皿放入分光光度计前，擦拭其透明侧面。注意将比色皿的透明面与分光光度计中的光束对齐。
表2：游离与结合中性红的吸光度
点击此处下载表 2比色皿 # 缓冲液 pH λ处的吸光度最大值 （游离NRH）+) λ处的吸光度最大 （结合态NRH） 1 5.0 2 5.5 3 6.0 4 6.5 5 7.0 6 7.5 7 8.0 8 8.5 9 11 10 空白 -
取10个1.5 mL比色皿及盖子，将盖子编号为1至10，与实验记录本中的表格相对应。
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将一个25 mL烧杯标记为“DIH2O”，并用去离子水装满。
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将中性水相废液倒入下水道，并将烧杯重新标记为“水相缓冲液废液”。
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标记一个400 mL烧杯，用于盛放使用过的移液器吸头。
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将枪头安装到1 mL微量移液器上，吸取1000 µL去离子水加入比色皿10中。此为溶剂空白对照。
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将925 µL pH 7.0的磷酸二氢钠缓冲液加入比色皿5中。
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将剩余的空比色皿带到缓冲液操作台。根据实验记录本中的表格，使用已标记的移液器将925 µL的每种缓冲液分别加入相应的比色皿中。注意不要用同一个吸头接触不同的缓冲液。
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完成后，将缓冲液带回实验台。将200 µL移液器调节至75 µL的排液量，并在移液器上安装一个吸头。
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向九个缓冲比色皿中各加入75 µL中性红溶液。轻轻颠倒比色皿数次，充分混匀溶液。 注意： 若移液器吸头接触到缓冲液，请更换吸头。
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将中性红与每种缓冲液混合后，拍摄照片或记录下溶液的颜色。
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打开手持式分光光度计，使光源预热。待设备准备就绪后，新建一项实验，用于测定游离中性红的吸光度随波长的变化。
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插入去离子水比色皿，采集去离子水的光谱，将其设为溶剂背景或空白。
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然后，取下空白样品，换上在最低pH缓冲液中的中性红比色皿，该溶液中质子化中性红的浓度最高。
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获取光谱，应显示一个强峰。确定该峰最高点对应的波长，即最大值。将此波长记录在实验记录本中，作为质子化游离中性红的λmax。
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保存数据并取出比色皿。在实验记录本中记录吸光度，然后使用相同步骤对2至9号比色皿进行光谱采集。
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记录等吸光点的波长于实验记录本中。该点是所有光谱在单一波长处相交的位置。若某光谱未在该点相交，则清空并清洗比色皿，制备新的样品后重新测量。
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完成所有九个比色皿的光谱采集后，保存并导出数据。
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创建一个新实验，用于测量结合态中性红的吸光度随波长的变化。
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为200 µL微量移液器安装新的吸头，向每个比色皿（包括空白对照）中加入75 µL核黄素结合蛋白溶液。弹出吸头，盖紧比色皿盖，倒置比色皿数次以充分混匀溶液。
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将比色皿10放入分光光度计中，设为溶剂空白对照。
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获取最低 pH 值样品的光谱，确定最强峰最大值对应的波长。在实验记录本中将其记录为质子化结合态中性红的 lambda max。
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以与游离中性红样品相同的方法，获取第2至第9号比色皿的光谱。在表格中记录质子化结合态中性红在λ最大值处的吸光强度，以及等吸收点（isosbestic point）处的波长。
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完成操作后，保存数据，导出以供后续分析，并关闭分光光度计。
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收拾所有设备，并将使用过的移液器吸头弃置于经批准的废物容器或垃圾桶中。
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将比色皿中的溶液倒入盛有水相缓冲液废液的烧杯中，并用去离子水冲洗比色皿，冲洗液一并倒入该烧杯中。
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将多余的 NaOH 倒入碱性废液容器中，并用水冲洗量筒。
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用大量自来水将碱性废液连同其他水相废液一起冲入下水道。
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按照实验室标准操作程序清洗玻璃器皿、比色皿盖和搅拌子。使用湿润的纸巾清洁工作台面，并将使用过的纸巾和实验室擦拭纸丢入实验室垃圾桶中。
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- 结果
现在，让我们分析吸光度数据，以确定中性红的pKa值。
表3：中性红pKa值的测定
游离型NRH+ 结合态NRH+ λ最大值 （纳米） ΔA (nm) 中点（nm） pKa -
将两组强度数据绘制成图，以最大波长处的吸光度强度为纵坐标，pH 为横坐标，用平滑曲线连接各数据点。
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计算每组数据起始与结束吸光度强度之间的差值。
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确定每组实验起始与终止吸光度的中间值，即吸光度中点。
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找到每条线上中点的位置，并确定该点处的 pH 值。这些 pH 值分别为游离态和结合态中性红的 pKa 值。
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此处，中性红结合前后pKa值约升高1个单位，表明结合态的质子化中性红的酸性比游离态的质子化中性红弱一个数量级。
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