缓冲区

来源:美国马里兰州约翰霍普金斯大学的 Smaa Koraym

1. >制备 50 mM NaH₂PO₄ 缓冲液，pH 7展开

   在本实验的第一部分，您将制备一种缓冲 pH 值为 7.0 的磷酸钠溶液。磷酸一钠是一种与共轭碱磷酸二钠的弱酸。未经调整的磷酸一钠溶液的 pH 值通常约为 4 - 6。

   缓冲液在接近其 pKa 时最有效，磷酸一钠的 pKa 为 6.8 至 7.2。因此，您将使用 NaOH 将平衡推向共轭碱，而不会改变缓冲液平衡的整体组成。

   • 在开始实验之前，计算制备 200 mL 50 mM 溶液所需的磷酸一钠质量。

     表 1:50 mM NaH₂PO₄ 缓冲液（pH 7.0

     ）的制备 <表格边框="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" 高度="247" 宽度="358"> NaH₂PO₄ 的摩尔质量 = 119.98 g/mol 溶液体积 （mL） 200 摩尔浓度 （mM） 50 NaH₂PO₄ （mol） 的摩尔数 所需质量 （mg） 1 M NaOH 的初始体积 （mL） 最终体积为 1 M NaOH （mL） 使用的 NaOH 体积 （mL） 所需去离子水量 （mL） 点击此处下载表 1
   • 首先，穿上必要的个人防护装备，包括实验服、防溅安全眼镜和手套。注意: 实验室的这一部分使用具有腐蚀性和毒性的 NaOH。倾倒和运输 NaOH 时要小心。
   • 用去离子水填充 250 mL 塑料洗涤瓶。
   • 标记两个 100 mL 烧杯，一个用于中性水性废液，一个用于碱性水性废液。
   • 使用提供的缓冲液校准您的 pH 计。完成后，将探头存放在其存储溶液中。
   • 去皮称量，然后用干净的刮刀根据您的计算量出所需的磷酸一钠量。在实验室笔记本中记录磷酸一钠的确切量。注意: 磷酸一钠会从空气中吸收水分，因此请迅速获得准确的测量值，并在完成后将容器盖紧。
   • 将磷酸一钠放入 400 mL 烧杯中，然后用实验室湿巾清洁抹刀。扔掉称量纸和实验室湿巾，然后返回通风橱。
   • 用量筒量出 175 mL 的去离子水。将水倒入磷酸一钠烧杯中，加入磁力搅拌棒。
   • 搅拌溶液，直到盐完全溶解，溶液看起来均匀。这通常需要 2 - 3 分钟。
   • 量取 15 mL 去离子水，倒入烧杯中。继续搅拌溶液，直到它再次变得均匀（约 1 – 2 分钟）。关闭搅拌电机。
   • 用去离子水冲洗 pH 探头，然后用搅拌棒上方的传感器将其夹在溶液中。
   • 将一个 10 mL 量筒和手表玻璃带到分配罩上，量出 10 mL 的 1 M NaOH。注意量筒中的确切体积。
   • 用手表玻璃盖住 NaOH，然后小心地将其放入通风橱中。
   • 继续搅拌磷酸一钠溶液。在监测 pH 读数的同时，使用一次性移液器以逐滴方式将 NaOH 缓慢添加到搅拌溶液中。一旦缓冲液 pH 值达到 7.0，将移液器中仍残留的任何 NaOH 放回量筒中。
   • 计算您添加到缓冲液中的 NaOH 体积。从 10 mL 中减去该体积，以确定必须向缓冲液中添加多少去离子水才能达到 200 mL 的总溶液体积。
   • 用另一个 10 mL 量筒测量去离子水，并将其加入搅拌溶液中以完成缓冲液的制备。
   • 用去离子水冲洗 pH 传感器，用装满储存液的盖子盖住，然后拔下或关闭探头。
   • 将 250 mL 聚乙烯瓶标记为"50 mM 磷酸盐一钠缓冲液，pH 7.0"。从溶液中取出磁力搅拌棒。
   • 用漏斗将缓冲溶液倒入贴标签的瓶子中，并盖紧盖子。
2. >自由和束缚中性红的吸收光谱Expand

   缓冲液可用于评估特定 pH 值的化合物。在本节中，您将在各种缓冲液中记录指示剂中性红的吸光度光谱。中性红的质子化形式是红色，去质子化形式是黄橙色，这意味着它们分别吸收绿色和蓝紫色光。因此，酸性和碱性形式具有不同的吸收波长。蛋白质结合会改变中性红的性质，从而改变其吸光度和 pKa。

   在测量了几个 pH 值下游离中性红的吸光度光谱后，您将向溶液中加入核黄素结合蛋白 （RP） 并再次测量吸光度。吸光度强度与浓度有关，因此您将在实验后使用光谱来确定游离红和结合中性红的 pKa。

   • 在实验室笔记本中绘制下表。对比色皿编号 1 到 10，并列出您将使用的 9 个缓冲液 pH 值。第 10 个比色皿将是去离子水空白。 注意: 始终握住带纹理的比色皿侧面，并在将比色皿放入分光光度计之前擦拭透明侧面。请记住将透明侧面与分光光度计中的光束对齐。

     表 2:游离红和结合的中性红的吸光度

     <表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 比色皿 # 缓冲区 pH 值 最大 λ 处（免费 NRH⁺） 最大 λ 处的绝对值（绑定 NRH） 1 5.0 2 5.5 3 6.0 4 6.5 5 7.0 6 7.5 7 8.0 8 8.5 9 11 10 blank 点击此处下载表 2
   • 获取 10 个 1.5 mL 比色皿和瓶盖，并在瓶盖上标记 1 到 10，以匹配实验室笔记本中的表格。
   • 将 25 mL 烧杯标记为"DIH 2 O"并装满去离子水。
   • 将中性废液水冲入下水道，并将烧杯重新标记为"缓冲液废液水"。
   • 标记一个 400 mL 的烧杯，用于使用过的微量移液器吸头。
   • 将吸头连接到 1 mL 微量移液器上，并使用它将 1000 μL 去离子水分配到比色皿 10 中。这是您的溶剂空白。
   • 将 925 μL pH 7.0 磷酸盐一钠缓冲液放入比色皿 5 中。
   • 将剩余的空比色皿带到缓冲表中。按照实验室笔记本中的表格，使用标记的微量移液器将 925 μL 每种缓冲液分配到适当的比色皿中。注意不要对不同的缓冲液使用相同的移液器吸头。
   • 完成后，将缓冲区带回工作台。在那里，将 200 μL 微量移液器设置为分配 75 μL，并将吸头连接到微量移液器上。
   • 将 75 μL 中性红分配到 9 个缓冲液比色皿中。将每个比色皿倒置数次以充分混合溶液。注意: 如果移液器吸头接触到缓冲液，请更换移液器吸头。
   • 将中性红与每个缓冲液混合后，拍张照片或写下溶液的颜色。
   • 打开手持式分光光度计，让光源预热。准备好后，创建一个新实验来测量游离中性红的吸光度与波长的关系。
   • 插入去离子水的比色皿，获取去离子水的光谱。将其设置为 Solvent Background 或 blank。
   • 然后，取出空白物，将中性红比色皿插入最低 pH 值的缓冲液中，该缓冲液将具有最高浓度的质子化中性红。
   • 获取一个光谱，该光谱应显示一个强峰。确定与此峰值的最高点或最大值相对应的波长。在实验室笔记本中将此波长记录为质子化游离中性红的 lambda 最大值。
   • 保存数据并删除比色皿。在笔记本中记录吸光度，然后使用相同的程序收集比色皿 2 - 9 的光谱。
   • 在实验室笔记本中记录等压点的波长。这是所有光谱在单个波长上交叉的地方。如果光谱在该点没有交叉，请清空并清洁比色皿，准备新样品，然后重试。
   • 收集完所有九个比色皿的光谱后，保存并导出数据。
   • 创建一个新实验来测量结合的中性红的吸光度与波长的关系。
   • 将新吸头安装到 200 μL 微量移液器中，并向每个比色皿中加入 75 μL 核黄素结合蛋白溶液，包括空白。弹出吸头，固定比色皿盖，然后将比色皿倒置数次以混合溶液。
   • 将比色皿 10 插入分光光度计，并将其设置为溶剂空白。
   • 获取最低 pH 值样品的光谱，并确定与最强峰的最大值相对应的波长。在实验室笔记本中将其记录为质子化结合的中性红的 lambda max。
   • 以与获取游离中性红样品相同的方式获取比色皿 2 - 9 的光谱。在表中记录质子化结合的中性红在 lambda max 处的强度，以及等压点处的波长。
   • 完成后，保存数据，导出以供以后分析，然后关闭分光光度计。
   • 收起所有设备，将用过的移液器吸头丢弃在经批准的垃圾桶或垃圾桶中。
   • 将比色皿倒入水性缓冲废液烧杯中，然后用去离子水将比色皿冲洗到烧杯中。
   • 将多余的 NaOH 倒入基础废物中，然后用水冲洗量筒。
   • 用大量的自来水冲入下水道的基本水性废物，以及其他水性废物。
   • 按照实验室标准程序清洗玻璃器皿、比色皿盖和搅拌棒。用湿纸巾清洁工作台面，并将用过的纸巾和实验室湿巾扔进实验室垃圾桶。
3. 结果展开

   现在，让我们分析我们的吸光度数据以确定中性红的 pKa。

   表 3:中性红 pKa 的测定

   <表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 免费 NRH⁺ 结合 NRH⁺ λ_最大值 （nm） ΔA （纳米） 中点 （nm） pKa

   点击此处下载表 3

   • 绘制两组强度数据，y 轴为 lambda max 的吸光度强度，x 轴为 pH 值，点由平滑线连接。
   • 计算每个数据系列的起始和结束吸光度强度之间的差异。
   • 确定每个系列的开始和结束吸光度之间的吸光度中间值，或吸光度中点。
   • 找到每条线上的中点位置，并确定该点的 pH 值。这些 pH 值是游离红和结合的中性红的 pKa。
   • 在这里，我们看到游离和结合的中性红之间的 pKa 增加了大约 1，这表明结合质子化的中性红比自由质子化的中性红弱一个数量级。

在本实验的第一部分，您将制备一种缓冲 pH 值为 7.0 的磷酸钠溶液。磷酸一钠是具有共轭碱磷酸二钠的弱酸。未经调整的磷酸一钠溶液的 pH 值通常约为 4 至 6。

缓冲液在接近其 pKa 时最有效，磷酸一钠的 pKa 为 6.8 至 7.2。因此，您将使用氢氧化钠将平衡推向偶联物碱，而不会改变缓冲液平衡的整体组成。在开始实验室之前，请计算制备 200 毫升 50 毫摩尔溶液所需的磷酸一钠质量。

实验室的这一部分使用氢氧化钠，它具有腐蚀性和毒性。倾倒和运输氢氧化钠时要小心。现在，让我们开始吧。

首先，穿上实验服、防溅安全眼镜和丁腈手套。接下来，用去离子水填充一个 250 毫升的塑料洗瓶。分别为中性和碱性水性废液的两个 100 毫升烧杯贴上标签。

然后，使用提供的缓冲液校准 pH 计。完成后，将探头存放在其存储溶液中。现在，将 400 mL 烧杯带到分析天平区域，以获得所需的磷酸一钠。

去一张称重纸去皮，用干净的抹刀根据您的计算量出所需的磷酸一钠量。磷酸一钠会吸收空气中的水分，因此请迅速获得准确的测量值，并在完成后将容器盖紧。在实验室笔记本中记录您测量的磷酸一钠的确切量。

然后，将磷酸一钠放入烧杯中，用实验室湿巾清洁抹刀。扔掉称量纸和实验室湿巾，然后返回通风橱。现在，使用量筒量出 175 毫升的去离子水。

将水倒入磷酸一钠烧杯中，加入磁力搅拌棒。在搅拌板上搅拌溶液，直到盐完全溶解并且溶液看起来均匀。这通常需要 2 到 3 分钟。

然后，用量筒测量 15 毫升去离子水。将去离子水倒入烧杯中，继续搅拌溶液，直到它再次变得均匀，这通常需要一到两分钟。然后，关闭搅拌电机。

用去离子水冲洗 pH 探头，然后用搅拌棒上方的传感器将其夹在溶液中。现在，将一个 10 毫升量筒和手表玻璃杯带到分液罩上，并量出 10 毫升 1 摩尔氢氧化钠。用手表玻璃盖住氢氧化钠，然后小心地将其放入通风橱中。

注意量筒中的确切体积。然后，继续搅拌磷酸一钠溶液。在监测 pH 读数的同时，使用一次性移液器以逐滴方式将氢氧化钠缓慢添加到搅拌溶液中。

一旦缓冲液 pH 值达到 7.0，将移液器中仍残留的任何氢氧化钠放回量筒中。然后，根据量筒中的初始和最终体积计算您添加的氢氧化钠体积。从 10 毫升中减去该体积，以确定您必须向缓冲液中添加多少去离子水才能达到 200 毫升的总溶液体积。

用另一个 10 毫升量筒测量您需要的去离子水，并将其加入搅拌溶液中以完成缓冲液的制备。用去离子水冲洗 pH 传感器，用装满储存溶液的盖子盖住，然后拔下或关闭探头。之后，将 250 毫升聚乙烯瓶标记为 50 毫摩尔磷酸一钠缓冲液，pH 7.0'使用镊子从溶液中取出磁力搅拌棒。

然后，在瓶口放置一个漏斗，将缓冲溶液倒入瓶中。取下漏斗，盖紧瓶子。现在，您可以进入吸收光谱部分。

缓冲液可用于评估特定 pH 值的化合物。在本节中，您将在各种缓冲液中记录指示剂中性红的吸光度光谱。中性红的质子化形式是红色，去质子化形式是黄橙色，这意味着它们分别吸收绿色和蓝紫色光。

因此，酸性和碱性形式具有不同的吸收波长。蛋白质结合会改变中性红的性质，从而改变其吸光度和 pKa。在测量了几个 pH 值下游离中性红的吸光度光谱后，您将向溶液中加入核黄素结合蛋白 （RP） 并再次测量吸光度。

吸光度强度与浓度有关，因此您将在实验后使用光谱来确定游离红和结合中性红的 pKa。在开始本节之前，请在实验室笔记本中画一个表格，列出比色皿编号、缓冲液 pH 值、游离质子化中性红的 lambda max 吸光度，以及结合质子化中性红的 lambda max 吸光度。对比色皿编号 1 到 10，并列出您将使用的 9 个缓冲液 pH 值。

第 10 个比色皿将是去离子水空白。始终握住带纹理的比色皿侧面，并在将比色皿放入分光光度计之前擦拭透明侧面。请记住将透明侧面与分光光度计中的光束对齐。

现在，让我们开始吧。获取 10 个 1.5 mL 比色皿和瓶盖，并在瓶盖上贴上 1 到 10 的标签，以匹配实验室笔记本中的表格。将 25 毫升烧杯标记为 DIH2O'，并装满去离子水。

然后，将中性水性废液冲入下水道，并将烧杯重新标记为水性缓冲废液。此外，为用过的微量移液器吸头贴上 400 毫升烧杯的标签。然后，将吸头连接到 1 毫升微量移液器上，并使用它将 1000 微升去离子水分配到比色皿 10 中。这将是您的溶剂空白。

现在，弹出吸头，将微量移液器设置为分配 925 μL，并连接新吸头。将 925 μL pH 7.0 磷酸盐一钠缓冲液放入比色皿 5 中。弹出吸头并盖上比色皿。

接下来，将剩余的空比色皿放入缓冲液表中。在实验室笔记本中的表格的引导下，使用贴有标签的微量移液器将 925 μL 的每种缓冲液分配到适当的比色皿中。注意不要对不同的缓冲液使用相同的移液器吸头。

完成后，将缓冲液带回工作台。在那里，设置一个 200 微升微量移液器以分配 75 微升，并将吸头连接到微量移液器上。现在，获取一小瓶或一管中性红溶液，可以与另一个学生小组共享。

将 75 μL 中性红分配到 9 个缓冲比色皿中。如果移液器吸头接触到缓冲液，请更换移液器吸头。完成后弹出移液器吸头并盖上比色皿。

现在，将每个比色皿倒置数次以充分混合溶液。将中性红色与每个缓冲液混合后，拍张照片或写下溶液的颜色。接下来，打开手持式分光光度计并等待光源预热。

准备好后，创建一个新实验来测量游离中性红的吸光度与波长的关系。然后，插入装有去离子水的比色皿。获取去离子水的光谱，并将其设置为溶剂背景或空白。

然后，从分光光度计中取出空白物，并将中性红的比色皿插入最低 pH 值的缓冲液中，该缓冲液将具有最高浓度的质子化中性红。获取一个光谱，该光谱应显示一个强峰。确定与此峰值的最高点或最大值相对应的波长。

在实验室笔记本中将此波长记录为质子化游离中性红的 lambda 最大值。保存数据并取出比色皿。在笔记本中记录吸光度，然后使用相同的程序收集比色皿 2 至 9 的光谱。

光谱都应该在一个点上交叉，称为等压点。在实验室笔记本中记录此点的波长。如果光谱在该点没有交叉，请清空并清洁比色皿，准备新样品，然后重试。

收集完所有 9 个比色皿的光谱后，保存并导出数据。然后，创建一个新实验来测量结合的中性红的吸光度与波长的关系。将新吸头安装到 200 微升微量移液器上，并获得一个共享的核黄素结合蛋白容器。

向每个比色皿中加入 75 微升核黄素结合蛋白溶液，包括空白。弹出吸头，固定比色皿盖，然后将比色皿倒置数次以混合溶液。现在，将比色皿 10 插入分光光度计中，并将其设置为溶剂空白。

然后，获取最低 pH 样品的光谱，并确定与最强峰的最大值相对应的波长。在实验室笔记本中将其记录为质子化结合的中性红的 lambda max。之后，以与获取游离中性红样品相同的方式采集比色皿 2 至 9 的光谱。

在表中记录质子化结合的中性红在 lambda max 处的强度，以及等压点处的波长。完成后，保存数据，将其导出以供以后分析，然后关闭分光光度计。收起微量移液器、吸头盒、pH 计和分光光度计。

将用过的移液器吸头丢弃在经批准的废液容器或垃圾桶中。现在，将比色皿倒入水性缓冲废液烧杯中，然后用去离子水将比色皿冲洗到烧杯中。在通风橱中，将多余的氢氧化钠倒入碱性废液中，然后用水冲洗量筒。

用大量的自来水将基本的水性废物与其他水性废物一起冲入下水道。按照实验室标准程序清洗玻璃器皿、比色皿盖和搅拌棒。最后，用湿纸巾清洁工作台面，并将用过的纸巾和实验室湿巾扔进实验室垃圾桶。

现在，让我们分析我们的吸光度数据以确定中性红的 pKa。首先，绘制两组强度数据，y 轴上为 lambda max 的吸光度强度，x 轴上为 pH 值，这些点用平滑线连接。然后，对于每个数据系列，计算起始和结束吸光度强度之间的差异。

使用它来计算每个系列的起始吸光度和结束吸光度之间的中间吸光度，或吸光度中点。现在，找到每条线上的中点位置，并确定该点的 pH 值。这些 pH 值是游离红和结合的中性红的 pKa。

在这里，我们看到游离和结合的中性红之间的 pKa 增加了约 1，这表明结合的质子化中性红比游离质子化的中性红弱一个数量级。