柱层析

来源：美国马萨诸塞州阿默斯特市马萨诸塞大学的 Lara Al Hariri 和 Ahmed Basabrain

1. 食用色素的柱层析展开

   在本实验中，您将使用柱层析法将绿色食用色素分离为其组分——蓝色和黄色染料，即亮蓝（erioglaucine）和柠檬黄（tartrazine）。首先，使用95%乙醇洗脱对硅胶吸附力较弱的染料；然后，用水将第二种染料从柱中冲洗出来。为了回收纯化的染料，您需要在每种染料带流出层析柱时分别收集。这些被收集的液体称为“馏分”（fractions）。

   • 开始前，请穿上实验服，戴上护目镜和一副腈手套。
   • 将层析柱或滴定管带到中央试剂区。取一小团棉花或玻璃棉，压入柱子顶部，并用一根长而钝头的金属丝或玻璃棒将其推至活塞上方，以堵塞柱底。注意：棉花必须固定稳妥，但不要压得过紧，以便溶剂能顺利通过。确保活塞可以自由旋转，不会被堵塞物卡住。
   • 将滴定管夹固定在铁架台上，并将柱子垂直夹紧，柱子下方留出约4英寸的空间。确保活塞处于关闭状态。
   • 将一个100 mL烧杯标记为“废液”，并置于柱子下方。
   • 接下来，在已去皮的称量舟中称取1 g沙子，并带回实验台。
   • 然后，在棉塞顶部上方约0.5 cm处标记柱子。
   • 在柱子顶部放置一个小漏斗，通过漏斗倒入足量沙子，使其在棉塞上形成约0.5 cm厚的沙层。这可以防止硅胶颗粒穿过棉塞进入您的馏分中。
   • 移除漏斗，并轻轻敲击柱壁，使沙子分布均匀。
   • 现在，准备您的洗脱液。将一个50 mL烧杯和一个50 mL量筒标记为“水”。
   • 用量筒量取50 mL去离子水，倒入烧杯中。
   • 然后，将另一个50 mL烧杯和另一个50 mL量筒标记为“乙醇”。量取50 mL 95%乙醇，倒入该烧杯中。
   • 现在，取4至5支干净的巴斯德移液管和一个移液球。沿柱子内壁缓慢加入7–8 mL乙醇。这一层溶剂可使您在倒入硅胶悬浊液时不会扰动沙层。
   • 打开活塞，将约1 mL乙醇排入废液烧杯，以排出活塞中的空气，并确认溶剂能顺利通过棉塞。确保沙层和棉塞中无干燥区域，并轻轻敲击柱壁以去除滞留的气泡。
   • 接下来，在柱子顶部放置一个干净的漏斗，并将第三个50 mL烧杯标记为“乙醇中的硅胶悬浊液”。
   • 小心称取5 g硅胶粉末，倒入已标记的烧杯中。
   • 然后，将硅胶、玻璃棒和乙醇量筒带到乙醇分配通风橱中。
   • 量取18 mL 95%乙醇，倒入烧杯中。用玻璃棒搅拌混合物，直至质地均匀，无干粉或结块残留。此过程通常需要约1分钟。注意：悬浊液应呈类似面糊的浓稠状，但仍能顺畅流动。若悬浊液过稠，可能导致漏斗堵塞或在柱中滞留气泡。
   • 待粉末完全悬浮于乙醇中后，将其带回实验台。再次搅拌悬浊液，确保质地均匀，然后立即倒入柱中。
   • 在硅胶沉降过程中，轻轻敲击柱壁以消除气泡。
   • 用1–2 mL乙醇冲洗烧杯，并将冲洗液倒入柱中。然后，移除漏斗并放置一旁。
   • 沿柱子内壁用移液管加入乙醇，以冲洗附着在管壁上的颗粒。然后，排空溶剂，直至弯月面刚好略高于硅胶顶部。
   • 现在，使用5 mL或10 mL量筒取约0.8 mL绿色食用染料溶液。
   • 用一支干净的移液管，将5至7滴染料溶液均匀地加在硅胶顶部。如有必要，可加入少量乙醇以保持硅胶始终被覆盖。
   • 在等待染料渗入期间，将两个干净的50 mL烧杯分别标记为“乙醇馏分”和“水馏分”。将柱子下方的废液烧杯更换为乙醇馏分烧杯。
   • 接下来，用乙醇填充柱子，第一毫升应沿柱子内壁缓慢加入，以避免扰动硅胶层。
   • 然后，将活塞部分打开，并调节至溶剂液面每15–20秒下降约1 mL。
   • 定期补充柱中乙醇，以保持其持续流动。确保硅胶上方始终至少有1 cm高的溶剂层。
   • 观察黄色和蓝色色带的分离过程。注意：如需暂时离开，请关闭活塞，防止柱子流干。避免单次中断超过1分钟，否则化合物色带会开始扩散。通常需要约20–35分钟，使迁移较快的染料完全流出柱子。
   • 一旦您已将迁移较快的染料全部收集到乙醇馏分烧杯中，立即关闭活塞，将乙醇馏分放置一旁，并将废液烧杯重新置于柱子下方。
   • 排空溶剂，直至弯月面刚好略高于硅胶顶部。然后，将废液烧杯更换为水馏分烧杯。
   • 用一支干净的移液管将去离子水加至柱子顶部。然后，稍微打开活塞，使水流以每15–20秒约1 mL的速度通过柱子。
   • 根据需要不断补充水，直到第二个色带完全流出柱子。此过程通常还需15–25分钟。完成后，关闭活塞，并将水馏分烧杯更换为废液烧杯。
   • 现在，将柱子完全排空，并保持活塞开启。
   • 在实验记录本中记录乙醇馏分和水馏分的颜色。

     表1：食用色素的柱层析

     	颜色	体积 (mL)
     乙醇馏分
     水馏分

     点击此处下载表1
   • 将各馏分倒入相应的50 mL量筒中，记录每份馏分的体积。然后关闭活塞，将柱子送至通风橱。
   • 在通风橱中将柱子垂直夹紧，以便硅胶干燥。实验结束后，指导教师将告知您如何清洗柱子或由其负责处理。
   • 现在，将收集的馏分以及剩余的乙醇、水和染料溶液排入下水道，并按常规清洗其余玻璃器皿。
   • 将使用过的巴斯德移液管丢弃至玻璃废弃物容器中。用过的纸巾和称量舟丢入实验室垃圾桶，并在离开前清洁实验台面。
2. 结果展开

   在本实验中，您观察到乙醇能够及时洗脱出蓝色的亮蓝（erioglaucine），但对黄色的柠檬黄（tartrazine）洗脱效果不佳。绿色染料的纸层析结果也显示出类似现象。因此，我们得出结论：亮蓝对硅胶的亲和力低于柠檬黄。

   现在考虑使用两种溶剂分别洗脱染料的优势。水的极性比乙醇更强，因此我们推测，单独使用水时两种染料的洗脱速度都会比使用乙醇更快。虽然仅使用水时总体溶剂用量会更少，但分离效果会更差，导致难以收集到纯净的馏分。

   另一种方法是在收集完亮蓝后继续使用乙醇洗脱柠檬黄，但这种方法需要很长时间并消耗大量乙醇。在亮蓝洗脱完成后切换为水作为洗脱剂，既节省了时间，又减少了溶剂浪费，同时未牺牲产物纯度。