层析柱

层析柱

在有机化学实验室中，有多种技术可用于纯化和分离化合物。柱色谱法是微量分离最可靠的分离技术之一，其中可用于分析的化合物少于 10 克。该技术根据化合物的物理性质（例如溶解度、极性、疏水性、大小和电荷）分离混合物中的化合物。

色谱基础知识

任何色谱系统的主要成分都是固定相、流动相和待分析的样品混合物。在柱色谱中，固定相通常是微量微珠，它们均匀地填充在垂直柱中。将流动相（也称为溶剂）的连续流添加到色谱柱顶部，该流动相通过重力流过固定相，或通过泵以受控流速流过固定相。

将样品溶解在少量溶剂中，然后加入到色谱柱顶部。添加更多溶剂以迫使样品流过固定相。混合物中的化合物根据其不同的性质在流动相和固定相之间分配，并形成离散的条带。

与固定相相互作用较强的化合物比与固定相相互作用较弱的化合物移动得更慢。因此，具有弱相互作用的化合物将比具有强相互作用的化合物更早离开色谱柱或洗脱。化合物与固定相相互作用的强度由延迟因子 （R_f） 定义，延迟因子是组分行进的距离与流动相行进的距离之比。通过首先进行薄层色谱来确定延迟因子。

高延迟因子值表示样品与固定相相互作用强烈，洗脱时间长。低延迟因子值表示样品与固定相的相互作用不是很强烈，洗脱速度更快。由于化合物的 R_f 值不同，它们会分流成单独的条带并在不同的时间从色谱柱中洗脱出来，因此可以通过从色谱柱下分馏出溶剂来单独分离它们。

色谱柱色谱注意事项

色谱柱是垂直方向的玻璃管或塑料管。色谱柱的尺寸范围从几厘米（例如巴斯德移液器）到米（例如工业色谱柱）。色谱柱的直径取决于要分离的样品量，而色谱柱的长度取决于分离的难度。最有效地划分为离散波段需要较薄的样品层;因此，确定合适的直径是一个至关重要的步骤。相对于色谱柱直径而言，如果样品体积过大，则与直径较大的色谱柱中相同体积的样品相比，会产生更宽且不太明确的谱带。

在选择柱子的长度时，必须考虑组件的 R_f 值。具有相似阻滞因子的组分可能难以分离，并且需要更长的色谱柱来分离各个谱带。具有非常不同的阻滞因子的化合物可能不需要长色谱柱，因为它们应该很容易分配。选择固定相时，重要的是要选择一种能为每种组分带来不同延迟因子的固定相。

制备色谱柱是运行色谱柱最关键的部分。色谱柱中填充的固定相质量应至少为样品质量的 20 倍。如果塔底部没有多孔盘，则应用棉花和一层薄薄的沙子填充。这可以防止固定相通过色谱柱出口损失。

填料塔有两种方法:干填料法和浆料法。在干法中，固定相以粉末形式转移到色谱柱中。然后用流动相/溶剂清洗色谱柱数次，以确保溶剂渗透到硅胶色谱柱的每个部分。如果作不当，这种方法会增加色谱柱中形成干斑、通道和气泡的可能性。这些缺陷将影响色谱柱对混合物成分进行分区的能力。

浆料法提供了更均匀的填充塔，不包含气泡、干燥区域和通道。对于这种方法，固定相与溶剂混合以形成一致的浆液。然后将浆料转移到塔上，同时敲击侧面以去除形成的任何气泡。在此步骤中，色谱柱的旋塞阀（如果有）应打开，以便溶剂排出。

硅胶色谱法

利用许多不同的特性来分离化合物的混合物，例如大小、电荷和疏水性。在有机化学中用于分离化合物的一种特性是极性。为此，硅胶和氧化铝凝胶是最常用的固定相。硅胶具有极强的极性，并与极性化合物形成强偶极-偶极相互作用。此外，由于硅胶表面存在 -OH 基团，它可以与分析物形成氢键。

混合物中极性最强的组分与硅胶紧密结合并缓慢通过色谱柱，而非极性组分在流动相中更易溶解，并快速通过色谱柱。因此，混合物的组分必须具有不同的极性。与固定相相互作用强烈的组分通过使极性流动相流经色谱柱来洗脱。

引用

1. Shuler， M.L.， Kargi， K.， DeLisa， M. （2017）.生物工艺工程，基本概念。新泽西州上马鞍河:Prentice Hall。
2. 哈里斯，哥伦比亚特区（2015 年）。 定量化学分析。纽约州纽约市:W.H. Freeman and Company。

柱色谱是一种使用填充柱根据化合物与固定相（通常为微珠形式）的相互作用来分离化合物的技术。珠子之间的空隙充满了溶剂。打开色谱柱可让溶剂流过固定相。当混合物上样到填充柱顶部，然后上样到更多溶剂时，混合物会进入流动相并流过固定相。

混合物的每种组分都以不同的方式与固定相相互作用。一些组分与固定相的相互作用较弱，因此在色谱柱中移动较快，而另一些组分与固定相的相互作用较强，因此移动速度较慢。这样可以将不同的化合物分离成条带，这些条带以小馏分的形式收集。这样可以纯化每种化合物。

那么，可以使用什么样的特性来分离混合物呢？最常用的特性之一是极性。为此，硅胶（二氧化硅的一种形式）通常用作固定相。硅胶通过偶极-偶极相互作用和氢键通过其表面形成的 -OH 基团与化合物相互作用。因此，极性化合物将与固定相发生强烈相互作用，而非极性化合物将与固定相发生微弱相互作用。

其他可用于分离的特性包括尺寸、电荷和疏水性。将固定相加载到色谱柱中的一种常见方法是作为固定相和溶剂的浆液。然后，通过让更多溶剂流过色谱柱来填充固定相，以压实浆料。固定相必须均匀填充，没有气泡、空通道或干斑。这些会破坏流动并导致条带混合。

选择色谱柱时，直径取决于要分离的样品的体积。样品应以薄而均匀的层覆盖色谱柱顶部。较厚的样品层会导致更宽的条带。色谱柱长度取决于化合物在固定相上的分离程度。与固定相具有相似亲和力的化合物需要较长的色谱柱才能充分分离。但是，对固定相亲和力截然不同的化合物混合物可以在较短的色谱柱上分离。

在本实验中，您将通过首先填充和制备硅胶柱来探索色谱柱色谱。然后，您将使用色谱柱分离绿色食用染料中的有色组分。