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鸡胚神经诱导检测方法

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DOI：

10.3791/1027

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2009年2月13日

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Center for Environmental and Genetic Medicine, Texas A&M University (TAMU)

本文内容

摘要

神经诱导是大脑形成的第一个步骤。该过程是一种由亨森结（组织中心）指导邻近组织获得神经命运的机制，即发育形成神经系统。本视频演示了在鸡胚中进行神经诱导实验的方法。

摘要

鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易操作性和可及性，使其成为研究神经系统形成及初始图式建立的理想模型。本视频演示了如何将组织中心组织移植到宿主中，该方法是将鸡胚中的组织中心——亨森结（Hensen's node）移植至具有发育潜能的宿主外胚层。组织中心移植物通过释放神经诱导信号，指导其上方未分化的组织转变为神经命运。这一机制被称为神经诱导，是羊膜动物脑和脊髓形成的第一步。该方法主要用于在鸡胚中鉴定潜在的神经诱导分子。本视频展示了神经诱导实验的各个步骤：首先，取出供体胚胎并固定于培养皿中；随后，准备宿主胚胎以进行新培养法（New culture）操作；接着，切下移植物并移植至宿主明区边缘区域；宿主胚胎继续培养18–22小时；最后，将样品固定并进行后续处理（如原位杂交）。该方法最初由瓦丁顿（Waddington）建立。 关键词：鸡胚，神经诱导，组织中心，亨森结，移植物，外胚层，原位杂交，Waddington 1,2和加莱拉3,4.

方案

一、示意图概述：

神经组织原位杂交实验示意图；细胞移植；供体-受体设置；异位轴诱导。

本视频展示了鸡胚神经诱导实验的各个步骤。首先，将宿主胚胎移植到新培养体系中 [NI1]。随后，将供体胚胎置于生理盐水中，并用荧光染料DiI标记亨森结（Hensen’s node，即鸡胚中的“组织者”）[NI2]。从供体胚胎中切除亨森结 [NI3]，并将其移植至宿主胚胎 [NI4, NI5]。之后将宿主胚胎培养最多22小时，在此期间，供体组织已在宿主的外胚层区域诱导形成异位轴结构 [NI6]。培养结束后，固定宿主胚胎并进行光氧化处理，过程中使用DAB：通过该化学反应，来源于供体的细胞在光氧化前在FITC荧光下呈红色 [NI7]，与DAB反应后则变为棕色 [NI8]。随后对胚胎进行原位杂交处理，使用神经标记物进行检测 [NI8]；结果显示，在供体移植物存在的情况下，宿主来源的组织已形成神经组织，该组织呈现蓝色。

1：为New培养法准备宿主胚胎

  1. 该神经诱导检测实验方案从孵化至哈amburger与Hamilton 3+期（或HH3+期）的鸡胚开始。这些鸡胚已在湿润的培养箱中侧放孵育13小时。
  2. 准备用于New培养的宿主胚胎（步骤3.1至5.59）。
  3. 用200 μl生理盐水覆盖宿主胚胎表面，以利于后续供体移植物的转移和定位。
  4. 最后，用倒置的Falcon 35 mm培养皿覆盖整个装置。

2：在生理盐水中分离供体胚胎

  1. 用镊子轻敲蛋壳并移除蛋壳各处的碎片，打开鸡蛋。取下蛋壳顶部并丢弃。
  2. 用镊子去除浓稠的蛋清，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。
  3. 使用精细剪刀在胚胎周围剪下一块方形的卵黄囊。用勺子将胚胎从卵黄上取出，放入含有PBS的培养皿中。
  4. 用镊子将供体胚胎从明区分离。
  5. 将供体胚胎转移至含有PBS的Sylgard包被培养皿中。

3：供体移植物的标记、切除与移植

  1. 使用微电极拉制仪拉制 50 μl 玻璃微量毛细移液管。在显微镜下，用精细镊子剪断微量移液管的尖端。将微量移液管放置在铺有塑泥条的培养皿中。
  2. 配制用于移植前标记移植物的染料溶液：碳菁染料 DiI（1,1’-二十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）：首先，将 DiI 溶于 1 ml 无水乙醇中，配制成 0.5% 的储存液。该储存液可于 -20°C 避光保存。在设定为 42°C 的水浴中，将预热的 40 μl DiI 储存液与 360 μl 0.3 M 蔗糖混合。水浴温度对于防止 DiI 沉淀和不溶性晶体形成至关重要。将溶液短暂离心（使用微型离心机，离心 5–10 秒）。此时 DiI 溶液已可使用。
  3. 使用昆虫针将供体胚胎固定在涂有 Sylgard 的培养皿底部。
  4. 用 DiI 溶液反向填充微量移液管。通过使用吸管装置施加轻微压力，将少量 DiI 溶液注入亨森结（Hensen’s node）。确保整个亨森结被充分标记。
  5. 使用微量毛细移液管或显微解剖刀，切下亨森结（“组织者”，供体移植物）。
  6. 用胭脂红在移植物的腹侧和后端做标记。这将确保在步骤 4.3 中移植物能以正确的背腹方向定位。
  7. 使用 200 μl Gilson 移液器将移植物转移至宿主胚胎。

4：固定移植物并培养宿主胚胎

  1. 移除宿主胚胎中的生理盐水，确保移植物仍紧邻宿主部位放置。
  2. 使用微毛细移液管或显微解剖刀，在宿主胚胎亨森结（Hensen’s node）水平的明区/暗区交界区域做一个小切口（80–100 μm）。
  3. 使用微毛细移液管或显微解剖刀，调整移植物位置，使其腹侧朝向操作者，后端与宿主胚胎相应区域平行。
  4. 除去残留的生理盐水，并将宿主胚胎进行New培养，持续81–22小时（步骤6.1至6.69）。
  5. 随后将宿主胚胎在4°C下固定过夜（步骤7.1至7.79）。

5：在荧光下对移植物进行光氧化

  1. 在通风橱内，用 Tris 缓冲液配制 DAB 工作液：将 DAB 底物（3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐）溶解于 Tris 缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 7.4）中，终浓度为 500 μg/ml；溶液避光并置于冰上保存。
  2. 用 PBS 洗涤胚胎两次，每次 5 分钟，再用 Tris 缓冲液洗涤一次，持续 5 分钟。
  3. 将胚胎转移至含有 1 ml Tris 缓冲液的玻璃凹面载玻片中。
  4. 用 1.5 ml DAB 溶液替换 Tris 缓冲液。将移液器吸头弃入装有 10% 次氯酸钠溶液的容器中，以去除 DAB 污染。在凹面载玻片上加盖盖玻片。
  5. 在 FITC（异硫氰酸荧光素）荧光下，将显微镜物镜聚焦于移植物上（供体细胞呈红色荧光），并暴露于 FITC 荧光下，直至所有红色荧光细胞变为棕色（此过程是由于 DiI 荧光染料在 DAB 存在下，经 FITC 激发光（488 nm）照射后，光转化生成不溶性棕色结晶所致）。该过程耗时约 20 分钟至 2 小时。
  6. 光氧化反应完成后，用精细镊子移去盖玻片。将胚胎转移至含有 PBTw（或含 0.1% Tween-20 的 PBS）的 20 ml 玻璃闪烁瓶中。
  7. 通过将盖玻片和玻璃凹面载玻片在 10% 次氯酸钠溶液中孵育，以灭活残留的 DAB。

6：对胚胎进行原位杂交、拍照和切片处理

  1. 进行原位杂交（步骤 3.7 至 6.59），仅用 DIG 标记的探针孵育胚胎。
  2. 进行拍照（步骤 8.29）和切片（步骤 8.3 和 8.49）。

代表性结果

在以下神经诱导实验示例中，供体移植物显示出可诱导宿主来源组织表达神经标志物Tailless。在此特定示例中，我们评估了正常情况下不具备“组织者”能力的胚胎区域获得神经诱导能力的情况：供体移植物来源于一个在3+期通过手术去除“组织者”区域的供体胚胎。消融后，供体胚胎在New培养体系中继续发育，直至缺损愈合，并形成类似亨森结（Hensen’s node）的结构。该结构随后用DiI标记，从供体胚胎中切除，并移植至宿主胚胎的明区/暗区交界处。经过New培养后，在宿主胚胎旁形成一个微型轴状结构：该微型轴由一束红色细胞（供体来源）和一个头部样结构（宿主来源）组成。在图（A）中，于固定前在FITC荧光显微镜下观察到供体来源的DiI标记细胞。这些供体来源的细胞已增殖形成微型脊索，表现为一束红色细胞。图（B）中，在DiI光转化后，这些供体来源的细胞呈棕色。供体移植物诱导了宿主来源神经组织的形成：该组织包含脑部前体细胞，这一点通过原位杂交检测到标志物Tailless的表达得以证实[引自6]。

显微镜下组织荧光的组织学对比图；图像A中显示明亮的红色染色。

注意：在此实验步骤中，我们使用了DiI标记的细胞，以便区分具有神经诱导能力的供体组织（红色/棕色）与宿主来源的“神经”组织（蓝色）。除了使用鸡源性的DiI标记供体移植物外，一些研究者也采用鹌鹑胚胎来源的供体组织替代鸡源组织 [例如 6]。这种替代方法同样能够区分供体与宿主组织。在此情况下，移植物（供体组织）来源于鹌鹑蛋而非鸡蛋。在完成步骤4.5后，对宿主进行整体免疫组织化学染色，使用特异性识别鹌鹑组织的抗体（QCP1），此时省略本方案中的步骤3.1至3.4以及5.1至5.7。以下展示该替代方法的一个示例：本实验中采用了与A、B相同的操作流程，但使用了鹌鹑来源的供体组织（如QCPN抗体表达所示[棕色]）：源自鹌鹑胚胎的再生脊索结已诱导宿主中泛神经标记物Sox2的表达 [转载自6]：

突出显示色素定位的植物有色体显微图像。

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讨论

本视频展示了进行神经诱导检测的各个步骤；该检测主要用于鉴定鸡胚中潜在的神经诱导分子，因此可广泛应用于多种研究，范围从胚胎学显微操作1-4; 6到揭示新的信号级联通路7,8，其最终目标均为理解脑及其余神经系统形成过程中的初始步骤。

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致谢

D.P. 获得美国国家药物滥用研究所颁发的露丝·柯施坦因奖（Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1）。本工作得到Margaret M. Alkek基金会对RHF的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
卵动物查尔斯河实验室优质可育受精后，HH3+期（14小时）
体视显微镜显微镜徕卡显微系统MZ9.5 或类似物
杂交孵育箱仪器设备Robbins Scientific，SciGeneM1000与倒置的Pyrex培养皿和500 ml ddH₂O联用2烧杯
Marsh 自动培养箱仪器设备里昂RX
Pyrex 培养皿
钟表匠’s 玻璃 50毫米工具VWR 国际66112-060
玻璃环工具物理植物设施切割4毫米厚的玻璃管（外径27毫米，内径25毫米）。无需精细抛光。
弯头镊子 (1)工具电子显微镜科学公司72991-4C
镊子（2）工具Fine Science Tools11002-13使用磨刀石将末端磨平，并加入100 μl矿物油
精细剪刀工具Fine Science Tools14161-10
塑料培养皿工具Falcon BD353001
橡胶球囊工具电子显微镜科学公司70980
DiI试剂InvitrogenD-282
吸液管组件工具Sigma-AldrichA5177-5EA
显微技术–电极拉制仪仪器设备Sutter Instrument Co.Sutter Instruments P-97 Flaming/Brown 微量移液器
巴斯德毛细吸管工具电子显微镜科学公司70950-12火焰下圆边
培养室工具先锋塑料030C
微毛细管工具Sigma-AldrichP1049-1PAK
显微解剖刀工具Fine Science Tools10056-12用于原位杂交前穿刺组织空腔
0.2 mm直径的微型针工具Fine Science Tools26002-20将1份固化剂与9份基质混合，37°C过夜孵育
焦碳酸二乙酯（DEPC）试剂电子显微镜科学公司15710
Sylgard 184 硅弹性体固化剂与基础剂道康宁0001986475将1份固化剂与9份基质混合，37°C过夜孵育
焦碳酸二乙酯（DEPC）Acros Organics10025025向1升PBS中加入1毫升DEPC；振荡混匀；高压灭菌
16% PFA电子显微镜科学公司15710

参考文献

  1. Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
  2. Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
  3. Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
  4. Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
  5. Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
  6. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
  7. Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
  8. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
  9. Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).

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