使用 gentleMACS 解离器制备小鼠脾脏单细胞悬液

摘要

本视频介绍了一种利用gentleMACS解离仪自动化解离组织以制备小鼠脾细胞单细胞悬液的简单且节省时间的技术。

摘要

单细胞悬液是细胞分离、细胞分析和细胞培养实验的前提条件。为避免繁琐且常带来不适的手工解离操作，gentleMACS解离仪可在可控且可重复的条件下高效地解离组织。gentleMACS解离仪能够高效解离小鼠脾脏，兼具节省时间、操作标准化和保障使用者安全的优点。 本视频介绍了如何使用gentleMACS解离仪解离小鼠脾脏。gentleMACS解离仪是一种自动化台式设备，可通过特制管材对组织进行机械解离，从而获得具有活性的单细胞悬液。解离完成后，脾脏组织经过滤、离心和重悬，可用于后续实验。

方案

仪器设备简介

1. 使用紫色 C 管将组织轻柔地解离成具有活性的单细胞悬液。
2. 采用 PBS/BSA EDTA 缓冲液进行细胞解离。该缓冲液的配制方法是将 1 份 BSA 储存液加入到 20 份含 EDTA 的 autoMACS 冲洗液中。
3. 使用 MACS 分离前过滤器，以确保解离后的组织样本中无任何细胞团块，从而促进后续 MACS 分离及分析的成功。

分离脾细胞

1. 使用 gentleMACS 解离仪将整个脾脏解离成单细胞悬液形式的脾细胞。
2. 开始操作前，根据脾脏质量向 C 管中加入相应体积的缓冲液。一只年轻成年雌性 BALB/c 小鼠的健康脾脏重量约为 80–120 mg。每 1 至 2 个此质量范围的脾脏需要 3 mL 缓冲液。来自年老动物或感染动物的脾脏通常更大，需在缓冲液中称重，并相应调整缓冲液体积。总缓冲液体积不得超过 10 mL。
3. 将解剖得到的脾脏加入含有 3 mL 缓冲液的 C 管中。
4. 确保 C 管盖拧紧，并将 C 管以管盖朝下的方式安装到解离仪上。
5. 启动解离仪。对于 1–2 个脾脏，选择程序 m_spleen_01，该程序运行时间为 56 秒。若脾脏数量更多，请使用程序 m_spleen_04；此程序适用于最多 720 mg 的脾组织。
6. 程序完成后，原始脾组织已被解离成脾细胞悬液。
7. 在室温下以 300×g 离心整个细胞悬液约 30 秒，以确保转子和定子上的所有细胞均被清除并收集到 C 管底部。
8. 使用 1000 微升移液器通过 C 管盖上的隔膜密封开口取出样本。

过滤步骤

1. 开始过滤步骤时，将解离的组织加入预分离滤器或孔径为 30 µm 的细胞筛中。若处理 1-2 个脾脏，细胞筛应适配 15 mL 离心管；若处理超过 2 个脾脏，则应适配 50 mL 离心管。
2. 让细胞悬液自然滤过，随后用 5 mL 缓冲液冲洗滤器。
3. 将含有细胞悬液的离心管在室温下以 300×g 离心 10 分钟，以收集所有脾细胞，形成脾细胞沉淀。
4. 获得解离后的脾细胞沉淀后，需吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于适量缓冲液中。

使用 gentleMACS 解离仪进行脾脏解离可获得高比例的活脾细胞，通过 MACSQuant 分析仪进行流式细胞术分析可证明这一点。死细胞由碘化丙啶染色。在提供的示例中，前向侧向散点图显示了制备的脾细胞。

讨论

为避免繁琐且常伴有疼痛的手动解离过程，gentleMACS解离仪可在受控且可重复的条件下高效地进行组织解离。该组织解离过程对细胞温和，所得细胞悬液具有较高的细胞活力。gentleMACS解离仪与C管联用，专为从多种组织制备单细胞悬液而设计。该仪器配备多种预设程序，可用于解离小鼠脾脏、肝脏、肺脏或神经组织。其程序与方案范围将持续扩展，以涵盖更多类型的组织。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
gentleMACS™ 起始试剂盒	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL 管	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ 冲洗液	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA 储存液	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
预分离滤器	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant 分析仪	Miltenyi Biotec	130-092-197
碘化丙啶溶液	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx