用于细胞生物学的蛋白质微接触印刷技术

摘要

微接触印刷技术被广泛用于在材料表面图案化蛋白质及其他分子。我们演示了该过程的基本步骤，即将纤连蛋白图案印制到玻璃表面。

摘要

在基底上对蛋白质及其他生物分子进行图案化的能力对于模拟细胞外环境的空间复杂性具有重要意义。Whitesides 团队开发的微接触印刷技术（http://gmwgroup.harvard.edu/) 在20世纪90年代中期彻底改变了这一领域，使专注于生命科学的实验室能够便捷地使用微电子/微加工技术。该方法的早期实现使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章在材料表面创建功能化化学物质的图案¹。自那时以来，已开发出一系列创新方法来对其他分子（包括蛋白质）进行图案化。². 本视频演示了制作聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章的基本过程，并展示了如何利用这些印章对蛋白质进行图案化，因为这些步骤仅用文字难以准确描述。我们以在玻璃盖玻片上图案化细胞外基质蛋白纤连蛋白（fibronectin）为例，具体说明图案化技术的应用。 微接触印刷过程中的一个重要组成部分是拓扑结构母版（topological master），PDMS印章即由此母版浇铸而成；母版上的凸起和凹陷区域会在印章中被镜像复制，并最终决定图案的形态。通常，母版由涂覆有光刻胶的硅片经光刻工艺制备而成，本实验即采用此方法。制备具有特定图案的母版需要专用设备，建议在专业加工中心或设施的协助下完成。然而，几乎任何具有表面拓扑结构的基底均可作为母版使用，例如塑料衍射光栅（参见试剂部分的一个示例），这类偶然获得的母版可提供现成且简单的图案。本实验方案从已获得母版的前提下开始操作。

方案

1. 溶液与材料的准备

这些步骤应提前数天进行。

1. 玻璃盖玻片。将盖玻片浸入 Linbro 7X 去污剂与水按 1 : 3 比例混合的溶液中，加热并搅拌至溶液澄清，浸泡 10 分钟以清洁盖玻片。随后用去离子水充分冲洗盖玻片，并在 450°C 下烘烤 6 小时。将盖玻片装入陶瓷染色架（见试剂部分）可简化此操作过程。
2. 用于印迹的蛋白溶液。按照生产商说明书将纤维连接蛋白（fibronectin）重悬，配制成浓度为 1 mg/ml 的储存液。

2. 从拓扑母版制备印章

这些步骤可提前数天进行。将印模图案朝上放置于带盖的培养皿中保存，例如组织培养皿。

1. 使用过滤的压缩空气或惰性气体气流清除母版上的松散灰尘。
2. 将母版有图案的一面朝上，放入一个略大于母版的塑料培养皿底部。60 mm 或 100 mm 的组织培养皿适用于此目的。
3. 在聚苯乙烯材质的 50 ml 离心管中，按固化剂与弹性体基质质量比 1 : 10 的比例混合 Sylgard 组分。使用塑料工具（如一次性移液管）充分混合。每平方厘米培养皿面积至少准备 0.2 ml 弹性体。
4. 将 50 ml 离心管在 300 ×g 条件下离心 5 分钟，以去除气泡。
5. 将弹性体浇注到母版上，然后置于真空干燥器中抽真空 30 分钟。
6. 在 65°C 烤箱中固化弹性体至少 2 小时。提高固化温度或延长固化时间可获得更硬的弹性体。待其冷却至室温。
7. 将印章薄片从母版上剥离下来。

3. 在玻璃上进行纤维连接蛋白的微接触印刷

1. 剪下一个单独的印章。初学者可选用面积为 4 mm × 4 mm 至 1 cm × 1 cm、厚度为 1–2 mm 的印章。将图案面朝上放置在载玻片或小型塑料培养皿上。
2. 将印章放入等离子清洗仪中，在真空条件下处理 30 秒。使用 Harrick Scientific 等离子清洗仪（见设备列表），并将其设置为最高输出功率，可使 PDMS 表面变为亲水性。处理时间过长会导致弹性体开裂。
3. 用去离子水将纤连蛋白溶液稀释至 50 µg/mL 的印迹浓度。
4. 在印章上滴加少量印迹溶液（10–50 µL）。溶液会扩散至亲水性表面。加入的溶液量应足以覆盖印章表面，但不可溢出边缘。让蛋白质在印章上吸附 5 分钟。
5. 使用 Kimwipe® 或其他洁净的纸巾，通过毛细作用吸除印章上大部分蛋白溶液，注意不要触碰图案区域。
6. 用洁净、干燥的惰性气体（如氮气）气流吹干印章上残留的溶液。
7. 用镊子将印章从载玻片上取下，翻转后与已清洁的玻璃盖玻片（待图案化表面）接触。在上方放置重物以确保良好接触。最佳压力取决于印章尺寸和图案；可先使用 5 g 的重物，并在后续印迹过程中进行调整。使印章与表面接触 1 分钟。
8. 小心拆开堆叠结构，将印章与盖玻片分离。
9. 用 PBS 剧烈冲洗图案化的盖玻片，随后用去离子水冲洗，以去除未吸附在表面的蛋白质。再用氮气气流吹干盖玻片。

 代表性结果

微接触印刷是一种在表面图案化分子的强大技术。该技术能够制造出尺寸从几十微米到几百纳米的结构；在图1A中，左侧的标志每个高度均为200 µm，而图1B中所示的绿色斑点直径为1 µm，中心间距为4 µm。图1B还展示了微接触印刷的一个重要特性，即它是一种加法工艺。可通过多轮微接触印刷在同一表面上构建多组分系统³。

讨论

微接触印刷技术在概念上简单且非常稳健，已被广泛应用于在多种基底上对各种分子进行图案化。然而，该过程仍具有一定的经验性。所要创建图案的具体几何形状、待图案化的蛋白质种类、施加的重量以及包被/压印条件均会影响压印质量。例如，当对较大特征结构施加过轻的重量时，常常会导致图案中出现间隙，如图1A右上角的标志所示。相反，若施加过重的压力，则会引起印章塌陷或变形，导致蛋白质非预期地沉积在图案特征之间的区域。再以另一个例子说明，某些特定蛋白质（如抗体）在省略等离子体处理步骤、保持聚二甲基硅氧烷（PDMS）处于亲水状态时，其图案化保真度更高。本文以纤连蛋白在玻璃表面的压印为例，作为此类改进与优化的起点，展示该技术的基本操作方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
等离子清洗机		Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-32G
干燥器		Nalge Nunc international	5315-0150
PBS	试剂	Invitrogen	10010-072
蛋白质标记试剂盒	试剂	Invitrogen	A30006
纤连蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	F2006
染色架	试剂	Thomas Scientific	8542E40
盖玻片	试剂	Fisher Scientific	12-544-12
Sylgard 184	试剂	Ellsworth Adhesives	184 Sil Elast Kit
衍射光栅	试剂	Edmund Scientific	3040267