使用Fura-2 AM对皮层神经元进行钙成像

摘要

钙信号在基因表达、细胞存活和分化等多种细胞过程中发挥关键作用。本文演示如何使用Fura-2 AM进行钙成像。钙成像是一种有价值的工具，可用于实时研究细胞内钙的调控及其对信号级联的调节作用。

摘要

钙成像是用于测量培养细胞中钙信号的常用技术。该技术利用基于BAPTA的有机分子钙离子指示剂染料，这类染料在结合Ca²⁺离子后会发生光谱性质的改变。钙指示剂染料可分为两类：一类是比率型染料，如Fura-2和Indo-1；另一类是单波长染料，如Fluo-4。比率型染料在钙离子作用下会改变其激发光谱或发射光谱，从而可通过在不同波长下的荧光发射或激发强度比值来确定细胞内钙离子浓度。与单波长探针相比，比率型染料的主要优势在于其比值信号不受染料浓度、光照强度以及光程长度的影响，因而可排除这些因素的干扰，独立地测定细胞内钙离子浓度。其中最常用的钙指示剂之一是Fura-2，其发射峰位于505 nM，在结合钙离子后激发峰从340 nm变为380 nm。本文描述了使用Fura-2检测神经元及其他可兴奋细胞中细胞内钙离子升高的方法。

方案

细胞培养

可采用既定技术培养细胞，但必须将细胞接种在涂有细胞黏附剂（如多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸或层粘连蛋白）的#1玻璃盖玻片上，以防止细胞在成像实验过程中脱落或移动。

溶液

可以使用多种生理溶液（包括细胞培养基）进行钙成像实验。但需要注意确保溶液中不含酚红，因为酚红会显著增加荧光背景。我们使用台氏液（Tyrodes solution），该溶液易于配制且成分模拟脑脊液，并添加0.1%牛血清白蛋白。通过使用60–90 mM氯化钾去极化以激活电压门控钙通道，或使用1 μM毒胡萝卜素（Thapsigargin，DMSO中储存浓度为1 mM）或2 μM离子霉素（Ionomycin，DMSO中储存浓度为1 mM）来激活储存操作型CRAC通道。为了证明钙水平升高源于钙内流，通常需要去除细胞外液中的钙。在去除钙时，必须保持二价阳离子（Mg²⁺ 和 Ca²⁺）的总浓度恒定。当以钾替代钠时，必须维持渗透压平衡。

台氏液溶液：

低钾 2 mM Ca2+Tyrodes（毫摩尔）

低钾 0 钙2+ 台罗德液（mM）

讨论

在本演示中，我们已介绍使用 Fura-2 AM 进行钙成像的全部操作步骤。我们以皮层神经元作为模型，但钙成像技术可用于多种细胞，以实时测量细胞内钙离子浓度。进行该操作时，必须使用玻璃盖玻片而非塑料材质，因为塑料在紫外波长下常具有自发荧光，会干扰成像效果。此外，盖玻片需预先用多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被，以防止细胞脱落。最后，向成像腔室灌注溶液时，务必避免产生气泡。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
新物品	Fura-2 AM	Invitrogen	F1221	避光保存
新物品	DMSO	Electron Microscopy Sciences	MX1457-6	置于干燥处以防吸湿
新物品	牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A8022-100G	4°下保存
新物品	成像腔室	Warner Instruments	型号 RC-20H
新物品	显微镜	Nikon Instruments	Eclipse TE2000-U
新物品	氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333-500G
新物品	校准试剂盒	Molecular Probes, Life Technologies	F6774	避光保存