人体内生物测定法用于组织特异性检测伤害感受性和炎症介质

摘要

本文介绍了一种从相关组织部位（此处为实验性炎症皮肤）体内采集间质液样本的技术，用于检测介导疼痛和炎症的生化物质。

摘要

该体内人体生物测定方法可用于研究人类志愿者和患者。通过无菌插入的微透析导管（Dermal Dialysis，Erlangen，德国）从相关组织部位（如皮肤）采集样本。本示例展示了从人类志愿者实验性炎症皮肤中收集间质液的过程。样本采集可与其他实验检测联合进行。例如，同时评估局部释放的生化物质以及实验性炎症皮肤对疼痛刺激的主观敏感性，可建立关键的生化-行为关联，从而识别疼痛与炎症的生物标志物。在活体人体中实施的该检测方法有助于揭示疼痛和/或炎症相关组织特异性过程的作用机制。该方法也适用于评估现有或新型干预措施（如新药候选物）在治疗疼痛和/或炎症性疾病方面的有效性。 本文将详细描述利用微透析技术从人类受试者实验性炎症皮肤病变部位采集间质液的方法。间质液样本通常采用多重微球阵列免疫分析法进行处理，可在低至50微升的样本体积中同时检测多达100种分析物。

方案

实验性炎症的诱导：

1. 使用校准的紫外线B光源（Saalmann Multitester SBB LT 499，Saalmann GmbH，Hereford，德国）在未晒黑的大腿皮肤上诱导一度晒伤。在开始微透析实验前24小时，通过施加足以引起暴露皮肤完全发红所需紫外线B光量的三倍剂量（即最小红斑剂量，MED的三倍）来诱导晒伤。每位受试者在研究开始前均测定其最小红斑剂量（MED）。通过紫外线计（RM 12，Dr. Grobel UV-Electronic GmbH，Ettlingen，德国）确保能量的精确输送。

导管置入与样本采集：

1. 准备一个操作区域，包括无菌手套、1 把无菌持针器、1 支带鲁尔接头的 1 cc 注射器（配有 23 号（G）针头）、1 支 1 cc 注射器（配有 30G 针头）、1% 利多卡因、酒精棉片、2×2 英寸无菌纱布垫、一端连接于 4 cm 23G 针头的微透析导管（Dermal Dialysis，Erlangen，德国）以及 1.5 ml 微量收集管（Microcent collection tubes，E&K Scientific，美国加利福尼亚州圣克拉拉）中，每100 µl样品加入4 µl蛋白酶抑制剂溶液，并置于干冰上。蛋白酶抑制剂溶液按照生产商说明，使用蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics GmbH，德国曼海姆）配制而成。
2. 用乳酸林格液配制1%人血白蛋白溶液，并将其吸入1 cc鲁尔接头注射器中，确保注射器内无任何气泡残留。
3. 将含有1%人血清白蛋白的乳酸林格液装入注射器，并置于安装在高精度输液泵（Pump 22，Harvard Apparatus，South Natick，MA）上的支架（微透析多注射器架，Harvard Apparatus，South Natick，MA）中。确保输液泵推动注射器的推杆与注射器活塞完全接触。在确认已将注射器直径准确输入泵后，设定泵速。常用的输注速率范围为2至4 µl/min。
4. 确定计划采集样本的区域。当从人工诱导的炎症区域（如上述日晒伤）取样时，应计划将导管插入日晒伤区域的边缘。
5. 用酒精清洁病灶或采样部位相对两侧边缘的小区域。这些清洁过的区域将作为微透析导管的预定插入点和穿出点。在这些部位皮内注射少量利多卡因，注射量以皮肤出现苍白（注射后皮肤变白）为标志，形成极小的皮丘（直径最大不超过2 mm）。在微透析导管的入口和出口处注射如此有限量的皮内利多卡因不会影响生物测定结果，但可显著减轻受试对象在导管插入过程中的疼痛感。
6. 使用无菌技术，在附带的23G针头辅助下，将微透析导管插入所探查的皮肤区域，导管长度应覆盖整个区域。插入深度应位于真皮与皮下组织交界处。可通过光学方式验证插入深度是否合适。当针头及其附带的导管向前推进时，应引起皮肤轻微隆起及局部皮肤发白。不应出现出血现象；若发生出血，则提示针头插入过深，需调整插入深度。当针头穿过皮肤出口点后，用含1%白蛋白的乳酸林格液冲洗导管，直至观察到液体滴沿导管全长渗出。操作方法为：将注射器（23G针头）针端小心插入微透析导管远端，缓慢注入溶液。
7. 冲管后，轻轻牵拉针头，使连接的导管通过皮肤。由于导管直径较小，因而较为脆弱，操作时需轻柔。持续牵拉导管，直至其完全穿过皮肤，即导管远端嵌入的较粗塑料管基部与皮肤穿入点接触为止。如上所述，操作结束时几乎无出血或无出血，表明导管位置理想。
8. 将导管远端连接至置于输注泵支架上的注射器23G针头的尖端。操作时需小心，避免针头刺穿导管管壁，以免造成潜在的泄漏。
9. 剪断导管近端的针头。
10. 使用¼英寸粉色胶带，将准备好的1.5 ml Microcent收集管固定在靠近导管出口部位的皮肤处。将导管尖端置入收集管内，以收集微透析液。以预设流速启动灌注泵，并定期检查灌注量与收集量是否一致。若灌注量与收集量不一致，应排除皮肤穿入部位是否存在渗漏（有时可通过将嵌入皮肤穿入部位的塑料管段更紧密地拉紧在皮肤上来解决）。若灌注量与收集量仍不一致，则可能需要更换导管。
11. 采样完成后，将样品置于干冰上，直至储存于-80ºC。

讨论

微透析技术与多重免疫分析技术的联合使用是一种有价值的实时、体内人体生物测定方法，可提供有关目标组织中生化事件的信息。结合疼痛测试等行为学检测，该方法可用于研究介导疼痛与炎症的生物化学物质之间的复杂相互作用。该方法在以下方面具有前景：1）识别介导疼痛和炎症的组织特异性生物标志物；2）揭示伴有外周组织病理改变的炎症性及慢性疼痛疾病的病理机制；3）探索新型候选药物及干预疗法的镇痛/抗痛觉过敏作用以及抗炎效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微透析导管	工具	皮肤透析	NA
Pump 22	工具	Harvard Apparatus	552219
Saalmann Multitester SBB LT 400	工具	Saalmann GmbH	NA
RM-12 IP-65 Radiometer	工具	Dr. Grobel UV Elektronik GmbH	82120000/81112100
完全蛋白酶抑制剂	试剂	Roche Group	11836145001
微量离心管	工具	E&K Scientific	380150-X
5% 白蛋白	试剂	ZLB Behring	NA
乳酸林格液	试剂	Hospira Inc.	NA
Xylocaine-MPF	其他	AstraZeneca	NA
1 mL 注射器	工具	BD Biosciences	309602