传统上，视网膜的垂直切片和整体装片制备方法被用于研究视网膜神经环路的功能。本文中，我们描述了一种新型切片方法，可完整保存视网膜神经元的树突形态。
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本文内容
摘要
摘要
传统上，研究视网膜神经回路功能常采用视网膜垂直切片和整体装片制备方法。然而，许多视网膜神经元（如无长突细胞）的树突呈水平方向延伸，因此在垂直切片中其细胞形态可能受到严重破坏。而在整体装片制备中，尤其是进行膜片钳记录时，由于胶质细胞（Müller细胞）终足广泛覆盖，视网膜中层的神经元难以接近。本文介绍一种新型切片方法，可完整保存视网膜神经元的树突形态。该方法将视网膜包埋于低温熔点琼脂糖凝胶后，使用振动切片机在视网膜内层进行水平切片。在此视网膜水平切片制备中，我们结合膜片钳记录、钙成像技术、免疫细胞化学和单细胞RT-PCR，对视网膜神经元的功能与其形态进行了联合研究。
关键词：视网膜，水平切片，振动切片机，树突形态，膜片钳记录，钙成像，免疫细胞化学，单细胞RT-PCR
方案
- 制备琼脂块（30 mg/ml，即 3%，溶于蒸馏水中）。先将其溶解并用微波炉加热，然后倒入玻璃皿中。将玻璃皿置于 4 oC 的冰箱中保存。
提示：琼脂块应提前制备。 - 制备低熔点琼脂糖凝胶（25 mg/ml，即 2.5%，溶于培养基中）。将其溶解并用微波炉加热，然后置于 35 oC 的水浴中保温。
提示：琼脂糖凝胶温度不宜过高。若温度过高，凝固时间将延长，且可能损伤视网膜。 - 处死动物，摘除眼球并将其打开成眼杯状。如需要，将打开的眼杯浸入含透明质酸酶（0.07 mg/ml）的培养基中 10 分钟，以液化玻璃体。
- 将琼脂切成一块（例如，小鼠视网膜可用 1 cm × 1.5 cm 大小），用瞬干胶牢固地固定在振动切片机的载物台上。保持琼脂块湿润。
- 将切片刀角度设为 5 度。以约 50 µm/sec 的速度、50 Hz 的频率，轻轻切削琼脂块的顶面。
提示：确保琼脂块顶面完全光滑平整。可能需要进行数次切割（至少 3 次）以获得光滑平整的表面。 - 用不含透明质酸酶的培养基冲洗眼杯。从色素上皮上分离出视网膜，并将其感光细胞面朝下放置在滤纸片上。为牢固地将视网膜贴附于滤纸上，需在滤纸上多次抽吸真空。
提示：确保视网膜完全平整地贴附在滤纸上。将视网膜置于滤纸上后，剪除视网膜周围多余的滤纸（图 2A）。多余的滤纸常会阻碍刀片进入视网膜的适当层次。 - 轻轻擦去琼脂块表面多余的培养基，小心地将带有视网膜的滤纸放置在琼脂块上。为牢固固定滤纸，可在滤纸边缘涂抹瞬干胶。
提示：为避免意外裂纹，应尽可能将视网膜放置在琼脂块顶面的前端位置。 - 轻轻将低熔点琼脂糖凝胶倒在视网膜上。等待 1 分钟后，再轻轻加入培养基以冷却。琼脂糖凝胶会迅速凝固。
提示：过热的琼脂糖凝胶会杀死视网膜。 - 将刀片位置抬高至琼脂块顶面上方数百 µm 处，轻轻切去凝固的琼脂糖凝胶顶部。
- 降低刀片位置。在内核层近端三分之一水平（约在琼脂块顶面上方 200 至 250 µm 之间）切开视网膜。
提示：刀片速度过快会严重损伤视网膜。约 50 µm/sec（50 Hz）较为合适。 - 注意此时无长突细胞已朝下。小心地将连同凝固琼脂糖凝胶的视网膜切片取出，并正面朝上置于孵育 chamber 或培养皿中。
提示：由于小鼠视网膜体积小且呈波浪状，难以在适当层次获得完美的水平切片。“斜切”方法可作为替代方案以获得相对平坦的视网膜切片。为实现斜切，可在滤纸上的视网膜与琼脂块之间插入另一张滤纸，如图 2B 所示。尽管无法获得完美的水平切片，但总会有部分区域的无长突细胞胞体位于切片表面。
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讨论
视网膜水平切片制备具有多个重要优势。
首先，能够水平延伸树突的细胞（如无长突细胞和水平细胞）的形态得以保留。研究表明，视网膜中存在超过20种类型的无长突细胞（MacNeil 和 Masland，1998），因此将细胞形态与其生理特性进行比较显得尤为重要。
其次，在整体视网膜中，胶质细胞终足的广泛覆盖阻碍了膜片钳电极对无长突细胞的接触。而在水平切片中，无长突细胞的胞体暴露于切片表面。
第三，由于细胞及其树突位于切片表面，化学试剂可轻易到达靶细胞及其树突。化学物质的灌注和清除快速且简便。
第四，可以进行荧光离子成像，例如常规的钙成像。在传统的垂直切片或整体视网膜标本中，成像所用的激发光本身会激活感光细胞。而在水平切片制备中，感光细胞和感光色素被完全去除，因此不会产生由激发光引发的伪迹干扰。此外，由于消除了感光细胞的背景活动，成像的信噪比显著提高。水平切片制备最大的缺点是感光细胞与节细胞之间的垂直连接被切断，因...
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披露
所有实验方案均按照美国国立卫生研究院关于动物使用的指南进行。
致谢
我们感谢Richard H. Masland博士和Akimichi Kaneko博士为我们建立视网膜水平切片制备方法提供了宝贵的建议和指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| 低熔点琼脂糖 L | 和光纯药工业株式会社 | 317-01182 | 低熔点琼脂糖 |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | I-S 型，300 U/mg | |
| 培养基 | 单位为 mM：102 NaCl、3.1 KCl、2.0 CaCl2、1.0 MgCl2、23 NaHCO3 和 10 葡萄糖，pH 维持在 7.8；或 Ames’ 溶液（Sigma） | ||
| 微波炉 | |||
| 恒温水浴 | 35 °C | ||
| 振动切片机 | Leica Microsystems | VT1000S | |
| 膜过滤器 | EMD Millipore | HAWP01300 | 滤纸，孔径 0.45 µm |
| 解剖工具 | 镊子、刀片、持针器、尖头镊等etc。 | ||
| 速干胶 | e.g. Alonalpha、Krazy Glue | ||
| 50 mL 注射器 | |||
| 注射器滤器 | EMD Millipore | SX0001300 |
参考文献
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
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