视网膜水平切片制备

摘要

传统上，视网膜的垂直切片和整体装片制备方法被用于研究视网膜神经环路的功能。本文中，我们描述了一种新型切片方法，可完整保存视网膜神经元的树突形态。

摘要

传统上，研究视网膜神经回路功能常采用视网膜垂直切片和整体装片制备方法。然而，许多视网膜神经元（如无长突细胞）的树突呈水平方向延伸，因此在垂直切片中其细胞形态可能受到严重破坏。而在整体装片制备中，尤其是进行膜片钳记录时，由于胶质细胞（Müller细胞）终足广泛覆盖，视网膜中层的神经元难以接近。本文介绍一种新型切片方法，可完整保存视网膜神经元的树突形态。该方法将视网膜包埋于低温熔点琼脂糖凝胶后，使用振动切片机在视网膜内层进行水平切片。在此视网膜水平切片制备中，我们结合膜片钳记录、钙成像技术、免疫细胞化学和单细胞RT-PCR，对视网膜神经元的功能与其形态进行了联合研究。 关键词：视网膜，水平切片，振动切片机，树突形态，膜片钳记录，钙成像，免疫细胞化学，单细胞RT-PCR

方案

1. 制备琼脂块（30 mg/ml，即 3%，溶于蒸馏水中）。先将其溶解并用微波炉加热，然后倒入玻璃皿中。将玻璃皿置于 4 ^oC 的冰箱中保存。
   提示：琼脂块应提前制备。
   
   
2. 制备低熔点琼脂糖凝胶（25 mg/ml，即 2.5%，溶于培养基中）。将其溶解并用微波炉加热，然后置于 35 ^oC 的水浴中保温。
   提示：琼脂糖凝胶温度不宜过高。若温度过高，凝固时间将延长，且可能损伤视网膜。
   
   
3. 处死动物，摘除眼球并将其打开成眼杯状。如需要，将打开的眼杯浸入含透明质酸酶（0.07 mg/ml）的培养基中 10 分钟，以液化玻璃体。
   
   
4. 将琼脂切成一块（例如，小鼠视网膜可用 1 cm × 1.5 cm 大小），用瞬干胶牢固地固定在振动切片机的载物台上。保持琼脂块湿润。
   
   
5. 将切片刀角度设为 5 度。以约 50 µm/sec 的速度、50 Hz 的频率，轻轻切削琼脂块的顶面。
   提示：确保琼脂块顶面完全光滑平整。可能需要进行数次切割（至少 3 次）以获得光滑平整的表面。
   
   
6. 用不含透明质酸酶的培养基冲洗眼杯。从色素上皮上分离出视网膜，并将其感光细胞面朝下放置在滤纸片上。为牢固地将视网膜贴附于滤纸上，需在滤纸上多次抽吸真空。
   提示：确保视网膜完全平整地贴....

讨论

视网膜水平切片制备具有多个重要优势。

首先，能够水平延伸树突的细胞（如无长突细胞和水平细胞）的形态得以保留。研究表明，视网膜中存在超过20种类型的无长突细胞（MacNeil 和 Masland，1998），因此将细胞形态与其生理特性进行比较显得尤为重要。

其次，在整体视网膜中，胶质细胞终足的广泛覆盖阻碍了膜片钳电极对无长突细胞的接触。而在水平切片中，无长突细胞的胞体暴露于切片表面。

第三，由于细胞及其树突位于切片表面，化学试剂可轻易到达靶细胞及其树突。化学物质的灌注和清除快速且简便。

第四，可以进行荧光离子成像，例如常规的钙成像。在传统的垂直切片或整体视网膜标本中，成像所用的激发光本身会激活感光细胞。而在水平切片制备中，感光细胞和感光色素被完全去除，因此不会产生由激发光引发的伪迹干扰。此外，由于消除了感光细胞的背景活动，成像的信噪比显著提高。水平切片制备最大的缺点是感光细胞与节细胞之间的垂直连接被切断，因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	A-1296
低熔点琼脂糖 L	和光纯药工业株式会社	317-01182	低熔点琼脂糖
透明质酸酶	Sigma-Aldrich		I-S 型，300 U/mg
培养基			单位为 mM：102 NaCl、3.1 KCl、2.0 CaCl2、1.0 MgCl2、23 NaHCO3 和 10 葡萄糖，pH 维持在 7.8；或 Ames’ 溶液（Sigma）
微波炉
恒温水浴			35 °C
振动切片机	Leica Microsystems	VT1000S
膜过滤器	EMD Millipore	HAWP01300	滤纸，孔径 0.45 µm
解剖工具			镊子、刀片、持针器、尖头镊等etc。
速干胶			e.g. Alonalpha、Krazy Glue
50 mL 注射器
注射器滤器	EMD Millipore	SX0001300