我们介绍一种从环境mRNA生成cDNA的方法。通常，首先从环境中收集总RNA，选择性去除rRNA，选择性扩增mRNA，然后从富集的mRNA群体合成cDNA并进行测序。回收的序列可通过标准的生物信息学技术进行注释，以鉴定表达的基因。
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摘要
摘要
与宏基因组学类似，环境转录组学（宏转录组学）能够从微生物群落中获取并测序环境mRNA，而无需预先了解该群落可能表达哪些基因。因此，它为群落基因表达提供了最为无偏的视角in situ. 环境转录组学实验方案在技术上较为困难，因为原核生物的mRNA通常缺乏多聚(A)尾，而多聚(A)尾的存在使得真核生物mRNA的分离相对简单1由于mRNA的半衰期相对较短2此外，mRNAs 在总 RNA 提取物中的丰度远低于 rRNAs，因此 rRNA 背景信号常常掩盖 mRNA 信号。然而，近年来已开发出一些克服上述部分困难的技术。最近报道了一种通过使用随机引物逆转录并扩增环境 mRNA 以构建克隆文库来分析环境转录组的方法，该方法在两种不同的自然环境中均取得了成功，但结果受到用于启动 cDNA 合成的随机引物选择的偏倚影响。3. mRNA线性扩增技术的进步消除了扩增步骤中对随机引物的需求，使得起始材料用量更少成为可能，从而缩短样本的采集和处理时间，进而最大限度地减少RNA降解4.体外用于扩增 mRNA 的转录方法包括对 mRNA 进行多聚腺苷酸化，并在转录本的 3′ 端引入 T7 启动子。随后，扩增的 RNA（aRNA）可利用随机六聚体引物转化为双链 cDNA，并通过焦磷酸测序直接进行测序。5. 在ALOHA站首次使用该方法展示了其在表征微生物群落基因表达方面的实用性6.
方案
RNA 操作
由于RNase无处不在且mRNA降解迅速，因此必须遵循无RNase环境操作的标准预防措施，样本在采集后应尽快进行处理或保存。
第1部分：环境RNA采集（旨在采集粒径为0.2–3.0 µm范围内的生物量）
所需材料：
Masterflex 软管
蠕动泵
3 µm 大体积折叠式胶囊滤器
0.22 µm Supor 或聚碳酸酯 142 mm 滤膜
142 mm 滤器支架（Geotech Environmental Equipment）
10–20 L 棕色玻璃桶（带刻度）
Whirl-Pak 取样袋
液氮
RLT 缓冲液（Qiagen）
β-巯基乙醇
操作准备：
在接触滤膜或滤过系统内部组件时，应始终佩戴洁净手套。镊子应存放于洁净的 50 ml 锥形管中，最好管内装有乙醇。为防止转录本群体发生显著变化，应尽可能缩短过滤及样品处理时间。
将软管一端置于采样所需水深位置，在另一端连接大体积 3 µm 滤膜。将 3 µm 滤膜与 0.22 µm 滤器支架相连。将 0.22 μm 滤膜的出流液直接导入带刻度的玻璃桶中。
实验步骤....
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讨论
近年来，研究自然微生物群落的基因表达已成为探索微生物生态功能和作用的常用手段。将基因表达分析与海洋微生物的检测、定量和表征相结合，可将系统发育与自然微生物群落的功能联系起来。许多针对功能基因表达的技术依赖于针对已知序列基因设计的特异性探针或引物组。相比之下，环境转录组学能够在不受现有序列数据限制的情况下研究基因表达，并优先关注那些正在活跃表达的基因。因此，对环境中mRNA群体的分析可能是揭示关键生物活动与其介导生物之间关联的最有效方法之一。
环境转录组学的最初应用首次揭示了自然生态系统中细菌mRNA库的组成和动态变化3。对来自沿海盐沼（佐治亚州萨佩洛岛）和碱性高盐湖泊（加利福尼亚州莫诺湖）转录文库中表达基因的分析，揭示了具有生物地球化学意义的基因序列，包括几类功能基因（如几丁质酶基因和硫氧化基因）在这些生态系统中的环境变异型。该研究还提供了证据，表明存在此前未知且出乎意料的微生物过程，例如微生物降解维管植物和藻类来源的多胺，可能作为碳源和氮源。
随着分子技术的发展，环境样品中RNA操作的局限性逐渐减少.......
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致谢
资金由戈登与贝蒂·摩尔基金会资助项目以及美国国家科学基金会资助项目 MCB-0702125 提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil 珠管 | 试剂盒 | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy 小量试剂盒 | 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | 试剂盒 | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY 原核生物 mRNA 分离试剂盒 | 试剂盒 | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress 细菌 mRNA 富集试剂盒 | 试剂盒 | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich 试剂盒 | 试剂盒 | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-细菌 RNA 扩增试剂盒 | 试剂盒 | Ambion | AM1790 | |
| 通用 RiboClone cDNA 合成系统 | 试剂盒 | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA 纯化系统 | 试剂盒 | Promega Corp. | A7280 |
参考文献
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsk....
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