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方法文章

利用环境转录组学分析海洋微生物群落的基因表达

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DOI：

10.3791/1086

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2009年2月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Marine Sciences, University of Georgia (UGA)

本文内容

摘要

我们介绍一种从环境mRNA生成cDNA的方法。通常，首先从环境中收集总RNA，选择性去除rRNA，选择性扩增mRNA，然后从富集的mRNA群体合成cDNA并进行测序。回收的序列可通过标准的生物信息学技术进行注释，以鉴定表达的基因。

摘要

与宏基因组学类似，环境转录组学（宏转录组学）能够从微生物群落中获取并测序环境mRNA，而无需预先了解该群落可能表达哪些基因。因此，它为群落基因表达提供了最为无偏的视角in situ. 环境转录组学实验方案在技术上较为困难，因为原核生物的mRNA通常缺乏多聚(A)尾，而多聚(A)尾的存在使得真核生物mRNA的分离相对简单1由于mRNA的半衰期相对较短2此外，mRNAs 在总 RNA 提取物中的丰度远低于 rRNAs，因此 rRNA 背景信号常常掩盖 mRNA 信号。然而，近年来已开发出一些克服上述部分困难的技术。最近报道了一种通过使用随机引物逆转录并扩增环境 mRNA 以构建克隆文库来分析环境转录组的方法，该方法在两种不同的自然环境中均取得了成功，但结果受到用于启动 cDNA 合成的随机引物选择的偏倚影响。3. mRNA线性扩增技术的进步消除了扩增步骤中对随机引物的需求，使得起始材料用量更少成为可能，从而缩短样本的采集和处理时间，进而最大限度地减少RNA降解4.体外用于扩增 mRNA 的转录方法包括对 mRNA 进行多聚腺苷酸化，并在转录本的 3′ 端引入 T7 启动子。随后，扩增的 RNA（aRNA）可利用随机六聚体引物转化为双链 cDNA，并通过焦磷酸测序直接进行测序。5. 在ALOHA站首次使用该方法展示了其在表征微生物群落基因表达方面的实用性6.

方案

RNA 操作

由于RNase无处不在且mRNA降解迅速，因此必须遵循无RNase环境操作的标准预防措施，样本在采集后应尽快进行处理或保存。

第1部分：环境RNA采集（旨在采集粒径为0.2–3.0 µm范围内的生物量）

所需材料：
Masterflex 软管
蠕动泵
3 µm 大体积折叠式胶囊滤器
0.22 µm Supor 或聚碳酸酯 142 mm 滤膜
142 mm 滤器支架（Geotech Environmental Equipment）
10–20 L 棕色玻璃桶（带刻度）
Whirl-Pak 取样袋
液氮
RLT 缓冲液（Qiagen）
β-巯基乙醇

操作准备：
在接触滤膜或滤过系统内部组件时，应始终佩戴洁净手套。镊子应存放于洁净的 50 ml 锥形管中，最好管内装有乙醇。为防止转录本群体发生显著变化，应尽可能缩短过滤及样品处理时间。

将软管一端置于采样所需水深位置，在另一端连接大体积 3 µm 滤膜。将 3 µm 滤膜与 0.22 µm 滤器支架相连。将 0.22 μm 滤膜的出流液直接导入带刻度的玻璃桶中。

实验步骤：

  1. 将数升水通过系统（不使用0.22 µm滤膜）进行冲洗。冲洗完成后，在泵运行时将管路从水中取出，以排空管路中残留的水分。
  2. 使用镊子将一张0.22 µm滤膜放置于滤膜塔上，并盖紧盖子。
  3. 将管路末端重新放入水中，启动泵，排出两个滤器中的空气。通过试剂瓶上的刻度监测过滤的水量。
  4. 当达到所需过滤体积后，将管路从水中取出，并排空系统中剩余的水分。
  5. 滤膜一旦变干，立即取下上层滤膜板并将滤膜折叠，迅速将滤膜放入含有2 ml含β-巯基乙醇的RLT缓冲液的旋盖袋或15 ml收集管中，随后在液氮中快速冷冻。

第2部分：从0.22 μm滤膜中提取总RNA

本步骤采用QIAGEN RNeasy mini试剂盒，并对生产商提供的说明书进行了部分修改

  1. 准备珠磨管：向一个50 ml的锥形管中加入8 ml RLT缓冲液（已添加β-巯基乙醇），再加入1–2 ml来自MoBio Powersoil提取试剂盒的RNA beads。
  2. 迅速从冰箱中取出冷冻滤膜，在保持其处于旋涡袋中的情况下，用锤子将其击碎。或者，使用无菌剃刀片在收集管（15 ml）中将滤膜切成小片，并全部转移至已准备好的50 ml管中。
  3. 将破碎的滤膜加入已准备好的50 ml管中，并用Parafilm或实验室封口膜密封管盖。
  4. 使用配备50 ml管适配器的涡旋振荡器，在最高速度下涡旋振荡10分钟。
  5. 将50 ml管在室温下以5000 rpm离心1分钟。
  6. 尽可能多地吸取裂解液，并将其转移至一个15 ml离心管中。
  7. 将15 ml管在5000 × g条件下离心5分钟。
  8. 将上清液（约7 ml）转移至一个新的50 ml管中。
  9. 向裂解液中加入等体积（约7 ml）的100%乙醇（EtOH）。
  10. 使用一个可插入50 ml管的30 ml注射器，通过18–21号针头将裂解液吸入并推出约5次。操作完成后，将裂解液保留在注射器中。
  11. 继续使用QIAGEN RNeasy Mini试剂盒进行提取。建议在此步骤使用真空抽滤装置，因为裂解液体积（约14 ml）远高于原始试剂盒说明书中的推荐体积（0.7 ml）。或者，也可通过每次向柱中加入700 µl裂解液，离心后重复操作，直至全部裂解液均被加载到柱上。
  12. 将离心柱置于真空抽滤装置上，加入700 µl样品，通过施加真空压力使裂解液流过柱子。继续从注射器中将剩余裂解液加入柱中，直至全部加载完毕。
  13. 向柱中加入700 µl RW1缓冲液，并通过真空压力使液体流下。
  14. 向柱中加入500 µl RPE缓冲液，并通过真空压力使液体流下。
  15. 再次向柱中加入500 µl RPE缓冲液，并通过真空压力使液体流下。
  16. 当洗涤液完全通过柱子后，取下离心柱并放入一个新的收集管中。
  17. 在8000 × g条件下离心1分钟，弃去穿滤液。
  18. 再额外离心2分钟（8000 × g），以彻底去除乙醇。
  19. 将离心柱转移至一个新的2 ml收集管中，用移液器将35 µl无RNase的水直接滴加到膜上。盖紧管盖，静置1分钟。
  20. 在8000 × g条件下离心2分钟。
  21. 通过分光光度法测定总RNA的浓度。

第3部分. DNA酶处理

此步骤按照生产商说明书使用 Ambion TURBO DNA-free 试剂盒

  1. 向RNA样品中加入3.4 µl 10x DNase I缓冲液和1 µl rDNase I。
  2. 在37ºC孵育30分钟。
  3. 涡旋混匀DNase失活试剂，然后向样品中加入3.4 µl失活试剂。
  4. 在室温下孵育2分钟，期间偶尔混匀。
  5. 在室温下以10,000 × g离心1.5分钟，随后将上清液转移至新管中。注意避免将失活试剂带入新管。

第4部分. 第一次rRNA去除

此步骤根据生产商说明书使用 Epicentre mRNA-ONLY 试剂盒

  1. 使用前轻轻混匀 mRNA-ONLY 10X 反应缓冲液，并短暂离心。
  2. 在无菌（无 RNase）的 0.5 ml 离心管中，于冰上混合以下反应组分：
    mRNA-ONLY 10X 反应缓冲液2.0 µl
    RNase 抑制剂0.5 µl
    总 RNA 样品（200 ng–10 µg）16.5 µl
    终止子外切酶（1 单位）1.0 µl
    总体积20.0 µl
  3. 在恒温循环仪（带加热盖）或水浴中，30°C 孵育反应 60 分钟。
  4. 通过苯酚/乙醇沉淀终止反应：
    1. 加入无 RNase 的 H2O 至总体积为 200 µl（即加入 180 µl）。
    2. 提取：加入等体积（200 µl）苯酚:氯仿（1:1），剧烈涡旋后，最高速离心 2–5 分钟。
    3. 移取水相（约 200 µl）。
    4. 加入 0.1 体积的 3 M 醋酸钠（20 µl）和 2.5 体积的冰冻 100% 乙醇（500 µl）。
    5. 在 -80ºC 孵育 15–30 分钟。
    6. 4ºC 下最高速离心 30 分钟以沉淀核酸；标记离心管方向以便后续吸取样品（沉淀可能难以观察）。
    7. 用移液器或抽吸装置弃去上清液。
    8. 用 500 µl 冰冻 70% 乙醇洗涤，涡旋重悬。
    9. 最高速离心 10 分钟，弃去上清液。
    10. 再次最高速离心 10 分钟以去除管中残留液体。
    11. 小心抽吸液体，并在通风橱中敞口放置约 10 分钟，彻底干燥沉淀。
    12. 用 15–20 µl 无 RNase 的 H2O 重悬（MICROBExpress 的最大上样体积为 15 µl）；室温静置 5 分钟。
    13. 在此步骤使用 Bioanalyzer 或 Experion 检测 mRNA 的 rRNA 污染情况及质量。
    14. 此步骤可作为暂停点，RNA 可于 -80ºC 保存。

第5部分. 第二次rRNA去除

该步骤根据生产商说明书使用 Ambion MICROBEnrich 和 MICROBExpress 试剂盒。这两种试剂盒均可多次使用，以提高真核生物（MICROBEnrich）和原核生物（MICROBExpress）rRNA 去除的效率。总 RNA 的上样量应为 2–10 µg，体积应小于 15 µl。因此，理想的上样浓度为 >150 ng/µl。

MICROBEnrich

  1. 用移液器将 300 µl 结合缓冲液加入 1.5 ml 离心管中
  2. 在最大体积为 30 µl 的溶液中加入 5–100 µg 总 RNA，并轻轻涡旋混匀
  3. 每 5 µg RNA 加入 2 µl 捕获寡核苷酸混合物至结合缓冲液中。轻轻敲击离心管，短暂离心使混合物沉降至管底
  4. 在 70°C 下变性 10 分钟
  5. 在 37°C 下退火 1 小时。在此孵育期间准备磁珠
  6. 通过在无核酸酶水中洗涤一次，再在结合缓冲液中洗涤一次来制备寡核苷酸磁珠（通常为 25 µl），每次洗涤之间使用磁力架捕获磁珠。将磁珠置于冰上保存。使用前 5 分钟恢复至室温
  7. 在加热块中将洗涤液预热至 37°C
  8. 将 RNA/捕获寡核苷酸混合物加入已洗涤的寡核苷酸磁珠中。非常轻柔地混匀离心管，并短暂离心
  9. 在 37°C 下孵育 15 分钟
  10. 将离心管置于磁力架上，静置约 3 分钟
  11. 吸除上清液（含有 mRNA），并将其转移至冰上的收集管中
  12. 向捕获的磁珠中加入 100 µl 预热的洗涤液。轻轻短暂涡旋磁珠
  13. 用磁力架捕获磁珠并回收上清液。将此上清液与冰上收集管中的 mRNA 合并（最终体积约为 450 µl）
  14. 将收集管置于冰上。若需进行第二轮操作，请返回第 5.3 节并重复操作步骤。或者，立即切换至 MICROBExpress 试剂盒（第 5.18 节，见下文）
  15. 使用过的 OlioBeads 可重复使用一次。通过将磁珠与两倍体积（通常为 50 µl）的再生溶液 1 孵育 1 小时来再生寡核苷酸磁珠。在磁力架中捕获磁珠。用两倍体积的再生溶液 2（通常为 50 µl）洗涤两次，并将其重悬于原始体积的重悬液中（通常为 25 µl）。
    MICROBExpress
  16. 用移液器将 200 µl 结合缓冲液加入 1.5 ml 离心管中
  17. 在最大体积为 15 µl 的溶液中加入 2–10 µg 总 RNA，并轻轻涡旋混匀
  18. 向结合缓冲液中的 RNA 加入 4 µl 捕获寡核苷酸混合物。轻轻敲击离心管，短暂离心使混合物沉降至管底
  19. 在 70°C 下变性 10 分钟
  20. 在 37°C 下退火 15 分钟。在此孵育期间准备磁珠
  21. 通过在无核酸酶水中洗涤一次，随后在 50 μl 结合缓冲液中洗涤两次来制备寡核苷酸磁珠，每次洗涤之间使用磁力架捕获磁珠。将磁珠重悬于 50 μl 结合缓冲液中，并在 37°C 下孵育直至使用
  22. 在加热块中将洗涤液预热至 37°C
  23. 轻柔地涡旋已洗涤的寡核苷酸磁珠。向 RNA/捕获寡核苷酸混合物中加入 50 µl 寡核苷酸磁珠。非常轻柔地混匀离心管，并短暂离心
  24. 在 37°C 下孵育 15 分钟
  25. 将离心管置于磁力架上，静置约 3 分钟
  26. 吸除上清液（含有 mRNA），并将其转移至冰上的收集管中
  27. 向捕获的磁珠中加入 100 µl 预热的洗涤液。轻轻短暂涡旋磁珠
  28. 用磁力架捕获磁珠并回收上清液。将此上清液与冰上收集管中的 mRNA 合并（最终体积约为 350 µl）
  29. 若需进行第二轮操作，请返回第 5.18 节并重复操作步骤。或者，立即进行 mRNA 沉淀
  30. 沉淀并重悬 mRNA：
    1. 向合并的 mRNA 中加入 35 µl 醋酸钠和 7 µl 糖原
    2. 加入 1175 µl 冰冷的 100% 乙醇，并充分涡旋
    3. 在 -20°C 下沉淀至少 1 小时
    4. 在 10,000 × g 条件下离心 30 分钟
    5. 小心倾倒并弃去上清液
    6. 加入 750 µl 冰冷的 70% 乙醇，并短暂涡旋
    7. 在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟，并弃去上清液
    8. 进行第二次 70% 乙醇洗涤
    9. 弃去第二次 70% 乙醇洗涤液后，短暂再次离心
    10. 用移液器小心去除残留上清液
    11. 将沉淀在空气中干燥 5 分钟
    12. 用 25 µl TE 缓冲液或无 RNase 水重悬 RNA 沉淀
    13. 在室温下水化 RNA 15 分钟
    14. 如有必要，剧烈涡旋样品
  31. 如有必要去除残留磁珠，将离心管置于磁力架上约 3 分钟，并将富集的 mRNA 转移至新的无 RNase 离心管中
  32. 在此步骤使用 Bioanalyzer 或 Experion 检测 rRNA 污染情况及 mRNA 质量
  33. 此为潜在的暂停点。RNA 可在 -80°C 下长期保存

第6部分：mRNA扩增

此步骤根据生产商说明书使用 Ambion MessageAmp II- Bacteria 试剂盒。可在 www.ambion.com/tools/ma2bact 在线计算主混合液配方。

  1. 模板RNA的多聚腺苷酸化：
    1. 将最多1000 ng总RNA（通常为100–500 ng）或最多500 ng mRNA（通常为10 ng–200 ng）加入无RNase的无菌微量离心管中。在第一种缓冲液中使用6.5 µl样品，不添加无RNase水。
    2. 在70°C孵育10分钟，建议使用PCR仪。
    3. 从70°C恒温箱中取出RNA样品，短暂离心（约5秒）以收集管底样品。将混合物置于冰上3分钟。
    4. 在无核酸酶的离心管中，于室温下按照计算表所示顺序配制多聚腺苷酸化主混合液。主混合液的配制量应涵盖实验中所有样本，并额外增加≤5%以补偿移液误差。轻轻涡旋混匀，确保混合均匀的同时避免使酶失活，随后离心约5秒，使主混合液完全沉降至管底。
    5. 将 3.5 µl 多聚腺苷酸化主混合液转移至每个 RNA 样品中，轻轻涡旋充分混匀，随后短暂离心以收集反应液。
    6. 将样品置于37°C培养箱中。在37°C下孵育反应15分钟，然后短暂离心，使反应液收集至管底。
    7. 37°C孵育后，将反应体系置于冰上，并立即进行逆转录。
  2. 逆转录合成第一链 cDNA：
    1. 在无核酸酶的离心管中，于室温下按照计算表所示顺序配制反转录主混合液。主混合液的配制量应涵盖实验中所有样本，并额外增加≤5%以补偿移液误差。轻轻涡旋混匀，确保混合均匀的同时避免失活酶活性，随后离心约5秒，使主混合液完全沉降至管底。
    2. 向每个样本中加入10 µl逆转录主混合液，轻轻涡旋混匀，然后短暂离心以收集反应液。
    3. 将样品置于42°C培养箱中，在42°C下孵育2小时，然后短暂离心（约5秒），使反应液收集至离心管底部。
    4. 将试管置于冰上，并立即进行第二条链 cDNA 合成。
  3. 第二链 cDNA 合成：
    1. 在冰上，按照计算表中所示顺序混合以下试剂，配制第二链主混合液。主混合液的配制量应涵盖实验中所有样本，并额外增加≤5%以补偿移液误差。轻轻涡旋振荡以充分混匀，避免使酶失活，随后离心约5秒，使主混合液全部收集至离心管底部。
    2. 将80 µl第二链混合液转移至每个样品中，轻轻涡旋混匀，然后短暂离心以收集反应液。
    3. 将样品置于16°C的热循环仪中。在加入反应管之前，必须先将热循环仪的金属块冷却至16°C，因为将反应暴露于过高温度下会 >16°C 会降低 aRNA 产量。
    4. 在16°C下孵育2小时，使用16°C的PCR仪进行孵育。如果加热盖温度无法调节至与16°C的加热块温度一致，请关闭加热盖后覆盖反应管；若加热盖无法关闭，则不要用其覆盖管子。
    5. 将反应物短暂置于冰上。切勿将反应物长时间留在冰上。
  4. 5.4）cDNA 纯化：
    1. 本纯化过程中所有离心步骤均应在室温下以10,000 x g（通常约为10,000 rpm）进行。使用cDNA结合缓冲液前应检查是否产生沉淀。若可见沉淀物，可通过将溶液在37°C温育最多10分钟并剧烈涡旋振荡使其重新溶解。使用前冷却至室温。
    2. 在开始cDNA纯化之前，将10 ml无核酸酶水预热至50°C，至少持续10分钟。
    3. 向每个样品中加入 250 µl cDNA 结合缓冲液，轻轻涡旋充分混匀。
    4. 离心约1分钟，10,000 g，或直至混合物完全通过滤膜。弃去滤过液，将cDNA滤柱转移至洗涤管中。
    5. 向每个 cDNA 过滤柱中加入 500 µl 洗涤缓冲液。在 10,000 g 条件下离心约 1 分钟，或直至洗涤缓冲液完全通过滤膜。弃去穿滤液，再将 cDNA 过滤柱离心额外 1 分钟，以去除微量乙醇。
    6. 将 cDNA 滤柱转移至 cDNA 洗脱管中。用 20 µl 50°C 无核酸酶水洗脱 cDNA。cDNA 洗脱时必须使用 50°C 的无核酸酶水。温度较低的水洗脱效率较低，而温度较高的水（>55°C 可能导致 aRNA 产量降低。
    7. 向cDNA滤芯的滤膜中央加入20 µl预热（50°C）的无核酸酶水。室温静置2分钟，然后在10,000 × g离心约1.5分钟，或直至所有无核酸酶水完全通过滤膜。此时双链cDNA将存在于洗脱液中（约16 µl）。
    8. 此时，纯化的 cDNA 可根据需要在 –80°C 保存过夜。
  5. 体外转录合成aRNA
    1. 建议使用杂交炉，因其温度均匀，且可确保管内不会形成冷凝水，这一点极为重要。为最大化扩增RNA（aRNA）产量，强烈推荐将体外转录（IVT）反应孵育时间设为14小时。为获得最高的aRNA产量，应将IVT反应终体积设为40 µl。
    2. 在室温下，按照计算表所列顺序依次加入试剂，配制体外转录（IVT）主混合液。轻轻涡旋充分混匀。短暂离心（约5秒），使IVT主混合液集中于离心管底部，然后置于冰上。
    3. 按照计算表的指导，将体外转录主混合液转移至每个样品中，轻轻涡旋混匀，短暂离心以收集反应液，然后将试管置于37°C培养箱中。
    4. 37°C 下孵育 14 小时。
    5. 孵育后，向每个aRNA样品中加入无核酸酶水，使最终体积达到100 µl。轻轻涡旋充分混匀。如果立即进行aRNA纯化步骤，将稀释后的aRNA置于冰上。或者，可将aRNA在–20°C保存。
  6. aRNA 纯化
  7. 本节中的所有离心步骤均应在10,000 x g（通常约为10,000 rpm）条件下进行。
  8. 在开始aRNA纯化之前，将10 ml无核酸酶水预热至55°C > 10 分钟
  9. 向每个aRNA样本中加入350 µl aRNA结合缓冲液。轻轻涡旋振荡充分混匀，并立即进行下一步操作。
  10. 向每个aRNA样品中加入250 µl色谱纯100% EtOH，用移液器轻轻吹打混合3次。切勿涡旋混匀。混匀后应立即进行下一步操作。
  11. 将aRNA滤芯放入aRNA收集管中，然后将每个样品混合物用移液器加至aRNA滤芯的中心位置。
  12. 离心约1分钟，10,000 x g。继续离心直至混合物完全通过滤膜。弃去滤过液，将aRNA滤柱重新放入aRNA收集管中。
  13. 向每个 aRNA 滤柱中加入 650 µl 洗涤缓冲液。在 10,000 x g 条件下离心约 1 分钟，或直至所有洗涤液完全通过滤膜。弃去穿滤液，再将 aRNA 滤柱额外离心约 1 分钟，以去除微量乙醇。
  14. 将滤芯转移至新的aRNA收集管中。向滤芯中央加入75 µl预热至50–60°C的无核酸酶水。将无核酸酶水容器放回50–60°C的培养箱中。
  15. 室温静置2分钟，然后在10,000 × g条件下离心约1.5分钟，或直至溶液完全通过滤膜。
  16. 用另外75 µl无核酸酶水重复洗脱一次。此时aRNA将溶于约150 µl无核酸酶水中，收集于aRNA收集管中。弃去aRNA滤过柱。
  17. 将aRNA于–80°C保存，并尽量避免反复冻融。

第7部分：cDNA合成

本步骤采用 Promega Universal RiboClone cDNA 合成系统试剂盒，对生产商提供的说明书进行了轻微修改。标准输入量为 2 µg；对于 454 测序，建议起始 RNA 用量为 10 µg。如果浓度过低，可通过乙醇沉淀或真空浓缩对 aRNA 进行浓缩。若 RNA 输入量为 10 µg，则所有试剂的用量均需按 5 倍比例放大。由于不同批次的酶单位不同，每次实验均需重新计算酶的使用体积。

  1. 第一链合成：
    1. 取一个 0.5 ml 的 PCR 管，加入以下成分：
      mRNA 样品2 μg（若用于 454 测序则为 10 μg）
      随机六聚体引物（0.5 mg/ml）2 μl
      核酸酶-free 水，加至指定体积0 μl（若样品已稀释则无需添加）
      总体积15 μl
    2. 将反应液在 70°C 加热 10 分钟。然后将离心管置于冰上冷却 5 分钟，并短暂离心以收集管底液体。
    3. 按以下顺序加入下列组分：
      样品15 μl
      第一链 5X 缓冲液5 μl
      RNasin 核糖核酸酶抑制剂 40 u1 μl … 40 u/μl
      总体积21 μl
    4. 混匀反应液并短暂离心。在 37°C 下孵育 5 分钟。
    5. 加入以下组分：
      步骤 1 的样品21.0 μl
      焦磷酸钠，40 mM2.5 μl
      AMV 逆转录酶 30 u1.5 μl … 22 u/μl
      核酸酶-free 水0.0 μl
      总体积25.0 μl
    6. 在杂交炉中 37°C 孵育反应 1 小时。
    7. 孵育结束后将反应管置于冰上。
  2. 第二链合成：
    1. 加入以下组分：
      第一链反应产物25.0 μl
      第二链 2.5X 缓冲液40.0 μl
      BSA，1 mg/ml5.0 μl
      DNA 聚合酶 I 23 u3.0 μl
      RNase H 0.8 u0.5 μl … 1.5 u/μl
      核酸酶-free 水26.5 μl
      总体积100.0 μl
    2. 通过轻弹管壁轻轻混匀。在热循环仪中 14°C 孵育 2 小时。在加入反应管前，必须先将热循环仪预冷至 14°C。在反应开始前及反应过程中，切勿使反应温度超过 14°C。
    3. 为终止反应，按每微克输入 mRNA 加入 2 单位 T4 DNA 聚合酶。在 14°C 下继续孵育 10 分钟。
    4. 加入 10 μl 的 500 mM DEPC 处理的 EDTA 以终止反应，并将反应管置于冰上。
    5. 根据生产商说明书，使用乙醇沉淀法或 Promega Wizard DNA 清洁系统对 cDNA 进行纯化。样品可于 -80°C 保存。此时双链 cDNA 可直接用于焦磷酸测序。

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讨论

近年来，研究自然微生物群落的基因表达已成为探索微生物生态功能和作用的常用手段。将基因表达分析与海洋微生物的检测、定量和表征相结合，可将系统发育与自然微生物群落的功能联系起来。许多针对功能基因表达的技术依赖于针对已知序列基因设计的特异性探针或引物组。相比之下，环境转录组学能够在不受现有序列数据限制的情况下研究基因表达，并优先关注那些正在活跃表达的基因。因此，对环境中mRNA群体的分析可能是揭示关键生物活动与其介导生物之间关联的最有效方法之一。

环境转录组学的最初应用首次揭示了自然生态系统中细菌mRNA库的组成和动态变化3。对来自沿海盐沼（佐治亚州萨佩洛岛）和碱性高盐湖泊（加利福尼亚州莫诺湖）转录文库中表达基因的分析，揭示了具有生物地球化学意义的基因序列，包括几类功能基因（如几丁质酶基因和硫氧化基因）在这些生态系统中的环境变异型。该研究还提供了证据，表明存在此前未知且出乎意料的微生物过程，例如微生物降解维管植物和藻类来源的多胺，可能作为碳源和氮源。

随着分子技术的发展，环境样品中RNA操作的局限性逐渐减少...

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致谢

资金由戈登与贝蒂·摩尔基金会资助项目以及美国国家科学基金会资助项目 MCB-0702125 提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PowerSoil 珠管试剂盒MoBio12866-25-PBT
RNeasy 小量试剂盒试剂盒Qiagen74104
TURBO DNA-free试剂盒AmbionAM1907
mRNA-ONLY 原核生物 mRNA 分离试剂盒试剂盒Epicentre BiotechnologiesMOP51010/MOP51024
MICROBExpress 细菌 mRNA 富集试剂盒试剂盒AmbionAM1905
MICROBEnrich 试剂盒试剂盒AmbionAM1901
MessageAmp II-细菌 RNA 扩增试剂盒试剂盒AmbionAM1790
通用 RiboClone cDNA 合成系统试剂盒Promega Corp.C4360
Wizard DNA 纯化系统试剂盒Promega Corp.A7280

参考文献

  1. Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
  2. Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
  3. Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
  4. Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
  5. Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
  6. Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
  7. Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).

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RNA rRNA mRNA cDNA
利用环境转录组学分析海洋微生物群落的基因表达
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