小鼠高架十字迷宫

摘要

高架十字迷宫实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细演示了该实验的操作流程。

摘要

尽管小鼠基因组现已完全测序，但大多数在脑中表达的基因功能仍不清楚。通过分析突变小鼠的行为表型，可以确定特定基因对某种行为的影响。如果目标基因在脑中表达，突变小鼠的行为表型可能揭示正常行为的遗传机制。高架十字迷宫实验是测量小鼠类焦虑行为最常用的实验方法之一。该实验基于小鼠对开阔和高处区域的天然厌恶，以及其在新环境中自发探索的自然行为。实验装置由相互垂直交叉的开放臂、封闭臂和中央区域组成。小鼠可自由进入各臂并自由活动。进入开放臂的次数以及在开放臂中停留的时间被用作评估小鼠由开阔空间诱发焦虑的指标。然而，不同实验室之间操作程序的差异使得实验结果难以在各实验室间重复和比较。本文展示了一段详细视频，演示我们实验室所采用的高架十字迷宫实验操作流程。在本实验室中，我们已使用该视频所示的方案评估了超过90种突变小鼠品系。这些数据将作为我们正在构建的公共数据库的一部分予以公开。 该操作流程的可视化展示将有助于更准确地理解整个实验的细节，促进不同实验室间实验方案的标准化，并便于比较使用该实验评估的各类突变小鼠品系的行为表型。

方案

实验方案

1. 用于高架十字迷宫实验的装置呈“+”字形，包含两条相对且相互垂直的开放臂（25 × 5 × 0.5 cm），以及两条与之垂直的封闭臂（25 × 5 × 16 cm），中央设有一个平台（5 × 5 × 0.5 cm）。开放臂具有一个极低（0.5 cm）的边缘，以减少动物坠落；而封闭臂则具有较高的侧壁（16 cm），以完全围合臂区。整个装置离地高度为50 cm（Ohara & Co., Tokyo），并放置在一个空的圆形水箱内（直径100 cm，高35 cm；通常用于Morris水迷宫实验），以防止实验过程中小鼠坠落或试图逃逸。该装置由塑料材料制成，平台为白色，侧壁为透明。高架十字迷宫装置在材料和颜色上存在不同变体。
2. 小鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环条件下（光照开启时间为上午7:00），饲养方式如前所述（Takao & Miyakawa, 2006a）。行为学测试在上午9:00至下午6:00之间进行。所有实验小鼠在首次试验开始前30分钟被转移至行为测试室，以适应测试环境。不同基因型小鼠的测试顺序采用交叉平衡设计。使用练习动物进行预试验有两个目的：一是确保录像系统正常运行；二是尽可能保持测试条件的一致性。否则，整个测试序列中第一个接受测试的小鼠所处的环境将与其他小鼠有所不同（例如，无先前操作产生的噪音，也无前次试验留下的气味线索）。动物的饲养与管理遵循京都大学动物研究委员会的指导方针。
3. 行为测试室（170 × 210 × 200 cm，Ohara & Co., Tokyo）为隔音设计，光照强度维持在100 lux。将小鼠放置于迷宫中央区域，使其头部朝向封闭臂。高架十字迷宫实验通过连接至计算机的视频摄像机进行记录，摄像机由遥控设备控制。记录每条臂的进入次数（定义为小鼠身体质心进入臂区即为一次进入）以及在开放臂中停留的时间，这些指标作为评估类焦虑行为的依据。
4. 允许小鼠在迷宫中自由活动10分钟。在本实验流程中，每只小鼠仅接受一次测试。用于采集和分析行为数据的应用程序（Image EP）基于公共领域的Image J程序开发（由美国国家精神卫生研究所Wayne Rasband开发，可访问http://rsb.info.nih.gov/ij/获取），并由Tsuyoshi Miyakawa进行了修改（可通过日本东京O'Hara & Co.获取）。
5. Image EP程序自动计算总移动距离、各臂进入次数、在各臂停留时间以及进入开放臂所占百分比。
6. 每次试验结束后，所有臂区及中央区域均使用超氧次氯酸水进行清洁。该清洁剂能有效去除气味，且自身气味较其他清洁液更微弱，从而避免因嗅觉线索导致的偏差。因此，我们可在受控条件下进行实验，排除嗅觉因素的干扰。

讨论

尽管小鼠基因组已被测序，但大多数基因的功能仍不清楚。基因修饰技术可用于在小鼠中删除或以其他方式操控特定基因（Austin 等，2004；Aiba 等，2007）。随后可通过对外显子小鼠进行行为学分析，来确定特定基因对某种行为的影响（Takao 和 Miyakawa，2006b；Takao 等，2007）。

高架十字迷宫实验是目前所有可利用的焦虑动物模型中最常用的测试方法之一（Rodgers 和 Dalvi，1997；Crawley，2007）。该实验已被广泛用于转基因和基因敲除小鼠的筛选与表型分析（Crawley，1999），以及新药研发（Hogg 等，1996；Crawley，2007）。高架十字迷宫实验对筛选抗焦虑药物具有高度的预测效度（Rodgers 和 Dalvi，1997；Mechiel Korte 和 De Boer，2003；Crawley，2007）；抗焦虑药物可特异性地增加进入开放臂的次数及在其中停留的时间，而促焦虑药物则特异性地减少这些指标。总进入次数和总移动距离被视为评估一般活动水平的有效指标。总进入次数也可作为焦虑程度的指标，而进入各臂的百分比及在各臂停留时间的百分比则构成主要焦虑指标（Rodgers 和 Dalvi，1997；Mechiel Korte 和 De Boer，2003）。开放臂与封闭臂被认为可引发相同的探索动机，因此对开放臂的回避被认为是恐惧水平升高的结果（Rodgers 和 Dalvi，1997）。一般认为，小鼠回避探索迷宫开放臂的行为源于对开阔和高处空间的恐惧。

1984年，Handley和Mithani报道了上述高架十字迷宫实验的初步研究工作。最初的实验装置距离地面70 cm，包含两个封闭臂和两个开放臂，每个臂长45 cm，宽10 cm。在他们的初期研究中，报告了开放臂进入次数与总进入次数的比值（Handley和Mithani，1984）。随后，其他研究者发展出更多指标，包括大鼠进入封闭臂和开放臂的次数，以及在封闭臂和开放臂中停留的时间（Pellow等，1985；Pellow和File，1986），以及小鼠的相关指标（Lister，1987）。

高架十字迷宫实验的改进包括延长开放臂（50 × 10 cm）和封闭臂（50 × 10 × 40 cm），封闭臂周围设有高墙但顶部开放，整个迷宫被抬升至离地50 cm的高度（Pellow等，1985；Pellow和File，1986）。目前，在我们实验室中，高架十字迷宫装置呈“+”字形，包含两条相对且相互垂直的开放臂（25 × 5 cm，带有约0.5 cm高的低矮边缘）和两条封闭臂（25 × 5 × 16 cm），整体架设于距地面50 cm的高度（Miyakawa等，1996；Manabe等，2000；Miyakawa等，2001；Seeger等，2004；Morishima等，2005；Miyamoto等，2005；Arrow等，2006；Hattori等，2007；Niemann等，2007；Sano等，2008；Horii等，2008；Fukuda等，2008；Ikeda等，2008）。将小鼠放置于“+”字中心区域（5 cm × 5 cm），允许其自由探索迷宫。尽管通常记录5分钟，但在我们的实验方案中记录时长为10分钟，以增加检测到表型的可能性。开放臂与封闭臂会引发小鼠的探索冲突行为（Mechiel Korte和De Boer，2003；Crawley，2007）。

在实验过程中，由观察者记录高架十字迷宫实验的各项指标。在我们的实验室中，该实验通过连接到计算机的摄像机进行录像，并使用Image EP程序获取和分析行为数据（Image EP）。进入开放臂次数与总臂进入次数的比值，以及在开放臂与封闭臂所花费时间的比值，用于评估类似焦虑的行为。

我们使用本视频中展示的方案评估了90多个基因工程突变小鼠品系，并获得了超过5000只小鼠（包括野生型和突变型小鼠）的大量原始数据。在我们的测试组合中，通常使用野生型同窝小鼠作为对照。作为背景品系，C57BL/6J小鼠被广泛使用。我们收集了C57BL/6J小鼠在行为学测试中的数据。在高架十字迷宫测试中，C57BL/6J小鼠获得的数据如下（n=914；均值 ± 标准误）：总移动距离：1547.55 ± 14.27 cm；在各区域停留时间：56.49 ± 2.42 s（开放臂）、384.02 ± 3.13 s（闭合臂）、161.90 ± 2.17 s（迷宫中心）；在开放臂停留时间占比：9.19 ± 0.36%，在闭合臂停留时间占比：63.82 ± 0.52%；进入次数：7.64 ± 0.21（开放臂）、24.32 ± 0.28（闭合臂）；开放臂进入次数占比：% open arm entries: 21.9 ± 0.05，闭合臂进入次数占比：% closed arms entries: 78.1 ± 0.05。C57BL/6J小鼠在开放臂停留的时间显著少于闭合臂（p<0.0001，n=914，配对t检验）。这表明C57BL/6J小鼠倾向于回避开放臂，因此在开放臂停留的时间是衡量焦虑样行为的有效指标。此外，不同基因型小鼠的测试顺序进行了交叉平衡，因为测试顺序会影响小鼠在开放臂和中心平台的停留时间。即，与第1只小鼠相比，第3和第4只小鼠的各项指标均有所上升（p=0.0089，n=476）（未发表数据）。根据我们的方案，对超过1661只小鼠的分析显示，同一笼中测试小鼠的顺序对在开放臂停留时间无显著影响（未发表数据）。也就是说，从笼中取出的第一只小鼠的表现与第二、第三或最后一只小鼠的表现无显著差异。

尽管高架十字迷宫实验和明暗穿梭实验均用于评估类似焦虑的行为，但两者的结果并不总是一致（Holmes 等，2000；Tujimura 等，2008；Nakajima 等，即将出版）。例如，前脑特异性钙调磷酸酶基因敲除小鼠在明暗穿梭实验中停留在明室的时间减少，但在高架十字迷宫实验中停留在开放臂的时间却增加（Miyakawa 等，2003）。我们对行为测试组合进行的因子分析表明，高架十字迷宫实验和明暗穿梭实验评估的是类似焦虑行为的不同方面，例如明暗穿梭实验反映的是对明亮空间的焦虑，而开放旷场实验反映的是对开阔空间的类似焦虑行为（Takao 和 Miyakawa，2006b；Yamasaki 等，2006）。因此，我们的行为测试组合中同时包含了明暗穿梭实验和高架十字迷宫实验。

Crabbe 及其同事报告指出，未受控的变量以及对突变体进行表征的实验可能会产生仅适用于特定实验室的结果（Crabbe 等，1999）。不同实验室之间存在的操作差异使得实验结果难以重复或相互比较。建立实验方案的可视化记录将有助于更好地理解实验操作流程，促进各实验室间所用方案的标准化，并便于比较通过这些测试评估的不同突变小鼠品系的行为表型。我们此前已发表过明暗交替实验的视频方案（Takao 和 Miyakawa，2006a）。同样，我们目前正在进行其他实验方案的视频制作，例如旷场实验、Porsolt 强迫游泳实验以及恐惧条件反射实验，这些实验均属于我们行为测试组合的一部分，未来将作为视频期刊文章发表。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高架十字迷宫	工具	O’hara Co.	（无）