果蝇幼虫神经肌肉接头解剖

摘要

本实验方案演示了如何解剖黑腹果蝇（Drosophila）幼虫，以制备用于神经肌肉接头的免疫组织化学和/或成像分析样本。

摘要

TheDrosophila神经肌肉接头（NMJ）是研究突触发育和可塑性的经典模型系统。该模型被广泛用于Drosophila运动系统因其高度可及性而备受关注。它可以在单细胞水平上进行分析。每个半体节有30块肌肉，其在外周体壁内的排列方式已知。共有35个运动神经元以高度保守的模式连接到这些肌肉上。利用分子生物学和遗传学方法，可以构建转基因动物或突变体，进而研究其对神经肌肉接头（NMJ）形态和功能发育的影响。为了研究NMJ，必须仔细解剖每条幼虫。本文将演示如何正确解剖Drosophila通过移除所有内部器官而保留体壁完整，以获取用于神经肌肉接头（NMJ）研究的幼虫。该技术适用于为成像、免疫组织化学或电生理学实验准备幼虫。

方案

开始之前

1. 所有培养物均应在 25° C 下培养。
2. HL3.1 解剖缓冲液可预先配制。取 50 ml HL3.1 并置于冰上保存。
3. 配制 15 ml 新鲜的含 3.5% 甲醛的 HL3.1 溶液，置于冰上保存。

幼虫解剖

1. 在解剖板上滴一滴冷的 HL3.1 溶液。这可以防止动物样本干燥，并使其暂时麻痹，便于操作。
2. 使用长镊子，选取一只处于三龄游走期的幼虫，并将其放入 HL3.1 液滴中。
3. 首先，用短镊子夹住一枚 minutien 针 ，将针置于后端气门之间。动物通常会试图远离针刺位置，从而伸展身体，这有助于你将另一枚针准确地插入幼虫头部靠近口钩的位置。沿纵向拉伸动物身体，这将有助于你在切割时最大限度地暴露体壁。注意：如果你选择先固定头部，动物可能会将身体缠绕在针上，或来回甩动身体，造成固定困难。此时通常可通过移除原有的 HL3.1 并更换一滴新的冷溶液来重新麻痹动物。双手灵活的研究人员也可直接用手抓握并固定动物。
4. 使用弹簧剪刀，在幼虫背部靠近后端固定针处稍前方做一横向切口。将剪刀的一侧刀片插入切口，沿背侧中线向头部方向进行纵向剪切。到达头端后，在固定针的左右两侧分别做横向切口。注意：最终的切割结果应在幼虫背侧沿头尾轴呈现出一个“I”字形。
5. 移除内部器官。首先在幼虫上再添加数滴 HL3.1 溶液，使器官浮起，便于取出。先移除气管系统，然后用镊子夹住其余组织并将其整体取出。
6. 在第 3 步中，你已在体壁上形成左右两个瓣状组织。按顺时针顺序将这两个瓣固定在板上，注意同时在水平和垂直方向上充分拉伸体壁。

固定

将每只动物在 HL3.1 溶液中用 3.5% 甲醛固定 25 分钟。用 HL3.1 溶液洗涤动物两次，每次 5 分钟。

储存

移除针具，并将幼虫转移至含有1× PBS的1.5 ml离心管中。若计划使用融合荧光标签对神经肌肉接头（NMJ）进行成像，应在两天内完成动物样本的成像。解剖后的幼虫可在4°C下保存最多一周。

代表性结果

正确解剖的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫包含几个关键要素。首先，操作时必须格外小心，避免损伤肌肉，尤其是第4、6和7号肌肉。这些肌肉是最常用于研究的，若受损，则应弃去该肌肉片标本，重新解剖另一只幼虫。其次，必须确保幼虫被充分拉伸，以便能够清晰区分每一块肌肉及神经肌肉接头（NMJ）。

讨论

本视频中演示的解剖技术可用于为多种实验方法制备黑腹果蝇（Drosophila）幼虫。如果存在荧光蛋白标签，可直接将幼虫装片并立即进行成像。否则，可通过免疫染色标记特定的突触区域。此外，还可对解剖后的幼虫进行电生理记录，以评估神经递质传递功能。

果蝇的神经肌肉接头（NMJ）自早期揭示其基本结构与功能的研究以来，已获得广泛关注^1-4。在果蝇 NMJ 发育研究中发现的许多分子在脊椎动物中具有保守性⁴。因此，通过研究果蝇 NMJ 所获得的诸多认识适用于所有生物的突触生物学。一些潜在的应用包括轴突导向相关分子、运动神经元疾病、学习与记忆等方面的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视显微镜 “体视显微镜” 2000	Carl Zeiss, Inc.	495101-9804-000
光源 KL 1500 LCD	Carl Zeiss, Inc.	000000-1063-181
3mm Vannas 弹簧剪	精细科学工具	15000-0
Dumont SS 镊子	精细科学工具	11200-33	长镊子
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20	短镊子
SylGard 182 硅酮弹性体试剂盒	道康宁	3097358-1004	用于制作解剖板
甲醛	Sigma-Aldrich	252549-25ML
不锈钢微型图钉 - 直径0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
HL3解剖缓冲液：（单位：mM）70 NaCl，5 KCl，0.2 CaCl2，20 MgCl2，10 NaHCO3，5海藻糖，115蔗糖和5 HEPES，pH 7.3。 Sylgard 解剖板：在烧杯中按10:1的比例轻轻混合（避免产生气泡）。将混合物倒入培养皿中（任意尺寸）。置于37°C培养箱中过夜，使Sylgard完全固化。
Sylgard 解剖板：在烧杯中按10:1的比例轻轻混合（避免产生气泡）。将混合物倒入培养皿中（任意尺寸）。置于37°C培养箱中过夜，使Sylgard完全固化。
Sylgard 解剖板：在烧杯中按10:1的比例轻轻混合（避免产生气泡）。将混合物倒入培养皿中（任意大小）。置于37°C培养箱中静置过夜，使Sylgard完全固化。
Sylgard 解剖板：在烧杯中按10:1的比例轻轻混合（避免产生气泡）。将混合物倒入培养皿中（任意尺寸）。置于37°C培养箱中过夜，使Sylgard完全固化。