本方案演示了如何对解剖后的黑腹果蝇幼虫进行免疫组织化学染色。
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本文内容
摘要
摘要
TheDrosophila神经肌肉接头（NMJ）是研究突触发育和可塑性的经典模型系统。该模型系统被广泛用于Drosophila运动系统因其高度可及性而备受关注。它可以在单细胞水平上进行分析。每个半体节有30块肌肉，其在外周体壁内的排列方式已知。共有31个运动神经元以高度保守的模式连接到这些肌肉上。利用分子生物学和遗传学方法，可以构建转基因动物或突变体，进而研究其对神经肌肉接头（NMJ）形态和功能发育的影响。免疫组织化学技术可用于清晰地成像NMJ的各个组分。在本文中，我们将演示如何使用抗体染色来可视化Drosophila幼虫神经肌肉接头
方案
开始之前
- 配制以下溶液：PBT（含 0.1% Triton X100 的 1X PBS）、PBTB（含 0.2% BSA 的 PBT）和 PBTN（含 2% NGS 的 PBTB）。
- 解剖黑腹果蝇幼虫。请参见 Drosophila 幼虫 NMJ 解剖。
免疫组织化学
- 将幼虫转移至含有PBT的1.5 ml离心管中。用PBT洗涤幼虫两次，每次15分钟。注意：洗涤时，将1.5 ml离心管置于摇床上。用移液器吸去液体，并更换为新鲜液体。
- 吸去PBT。用PBTB洗涤两次，每次30分钟。
- 吸去PBTB。用PBTN洗涤两次，每次15分钟。
- 将样本在PBTN中稀释的一抗溶液中孵育，室温下孵育1小时，或4º C过夜。
- 用PBTB快速冲洗两次。注意：冲洗时加入溶液后立即吸出。
- 用PBTB洗涤两次，每次15分钟。
- 用PBTN洗涤30分钟。
- 在PBTN中稀释的二抗（以及如果使用了偶联一抗）溶液中孵育。
- 用锡箔纸包裹，室温孵育1.5小时。
- 用PBTB快速冲洗两次。
- 用PBTB洗涤两次，每次15分钟。
- 进行封片操作。
封片
注意：如果样品需立即成像，请使用甘油封片。如果样品在成像前需要储存（超过一周）或需要多次成像，请使用Prolong Gold封片。使用时，将Prolong Gold瓶置于65°C水浴中2-3分钟。取适量Prolong Gold，并置于45-50°C的加热金属块上保温。
- 将染色后的样本连同PBT倒入表面皿中。
- 在干净的载玻片上滴加适量甘油用于后续处理。
- 用镊子夹取样本边缘，将其从表面皿中转移至处理用载玻片上，确保样本以角质层朝下放置。
- 在处理用载玻片上，使用新的剃须刀片切除样本的头部和尾部。使用16号刀片的精细刀具（exacto-knife）效果更佳。
- 在另一张载玻片（封片用载玻片）上滴加少量甘油/ProLong 溶液，并用干净的镊子将其均匀铺开。
- 将解剖后的样本从边缘轻轻转移至封片用载玻片，注意避免翻转。尽量将样本按相同方向排列成行，每张载玻片上封片6–8个样本。
- 加盖盖玻片时，先将一侧边缘接触甘油/ProLong 溶液，然后缓慢松开，使其自然覆盖。
- 用指甲油密封载玻片。注意：[必须等指甲油完全干燥后才能进行成像，通常需要十分钟。若样本使用ProLong Gold封片，应在密封或成像前至少干燥三小时。]
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讨论
免疫组织化学（IHC）对于神经肌肉接头（NMJ）生物学研究至关重要，因为它能够实现对NMJ的可视化观察。该方法通过使用识别神经元膜（例如HRP）、突触前膜（例如CSP、SYT）和/或突触后膜（例如DLG）的抗体来实现。此外，也可对信号分子、结构蛋白或感兴趣的新型蛋白进行染色。随后，可对基因进行突变或异常表达，再通过IHC检测突触结构和/或神经元信号传导的改变情况。
神经肌肉接头的 果蝇 自早期研究揭示其基本结构和功能以来，已广受欢迎。1-4 在研究中已鉴定出的许多分子 黑腹果蝇 神经肌肉接头在脊椎动物中具有保守性。4 因此，通过对果蝇NMJ的研究获得的见解可能适用于多种系统中的突触生物学。一些潜在的应用包括研究参与突触发育、可塑性及神经系统疾病的相关分子。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 体视显微镜 “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| KL 1500 LCD 光源 | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS 镊子 | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator 混匀器 | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 精密切割刀 | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 刀片 | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片试剂 | Invitrogen | 36930 |
参考文献
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
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