全质粒自制定点突变

摘要

对完整质粒进行定点突变是创建原始质粒微小变异体的简便方法。本文中，我们展示了一种利用常规试剂在质粒中引入碱基替换的简单且经济有效的方法。

摘要

对完整质粒进行定点突变是创建原始质粒微小变异体的一种简便方法。该方法可通过替换、删除或插入少数几个碱基，直接对克隆的目标基因进行修饰。其原理是通过非PCR依赖的热循环反应，对整个质粒进行扩增。在反应过程中，携带目标突变的突变引物被整合到新合成的质粒中。本视频教程演示了一种简便且经济高效地在质粒中引入碱基替换的方法。该方案使用常规试剂，不依赖昂贵的商业试剂盒。采用此方案可将反应总成本降低至某些商业试剂盒所需费用的八分之一。视频中我们还对实验过程中的关键步骤进行了说明，并详细介绍了如何设计突变引物。 关键词：定点突变，质粒，碱基替换，突变引物设计，热循环反应，分子克隆

方案

方法原理：

本视频介绍的全质粒定点突变技术是一种突变方法，可让您通过在质粒中直接替换、删除或插入少数几个碱基，对已克隆的目标基因进行改造。该方法通过非基于PCR的热循环反应扩增整个质粒。在反应过程中，携带所需突变（以与原始质粒序列不匹配的形式存在）的突变引物被整合到新合成的质粒中。反应结束后去除原始质粒，将突变后的质粒转化至E. coli中。后续步骤仅用于筛选目的，因为该方法的突变效率并非100%。整个过程耗时三天，但主要操作可在一天内完成。

1.0 第一天：

1.1 热循环反应：

原始质粒： 该定点突变实验方案最适合用于不超过10 kb的质粒。较大的质粒使用此方法进行突变相对困难，可能需要更多耐心，并调整热循环条件和/或感受态细胞。此外，所使用的质粒必须从dam+菌株中提取。进行热循环反应时，需要10至60 ng待突变的质粒。

引物： 在进行热循环反应之前，必须准备好引物。每种诱变引物需要约 150 ng。多取一些也可以 1.5 µl 1:10稀释的100 pM母液。设计诱变引物时，必须遵循以下几个简单原则：

• 引物应彼此互补
• 引物长度应在 25 至 45 个核苷酸之间
• 以与原始质粒不匹配形式存在的突变必须包含在两条引物中
• 不匹配区域应位于引物中央，并在两侧各至少有 8 个核苷酸的侧翼序列
• 引物的 GC 含量应至少为 40%
• 引物的 5' 端和 3' 端应以一个或多个 G 或 C 结尾
• 引物无需磷酸化，也无需经过 FPLC 或 PAGE 纯化，仅需脱盐即可
• 在计算 Tm 值时，无需使用任何公式，但引物发货证书上标注的 Tm 值应高于 60°C
• 出于筛选目的，可在引入突变的同时插入或删除一个限制性酶切位点。由于遗传密码具有简并性，因此在实现特定突变的同时插入限制性酶切位点有多种可能。New England Biolabs 官网提供了一个工具，可用于寻找合适的限制性酶切位点。只需输入编码目标氨基酸序列的引物序列，并使用 DNA 的简并碱基编码即可。该工具将显示可在引入目标突变的同时引入的限制性酶切位点。若通过此方法无法找到合适或实用的限制性酶切位点，也可在突变位点处插入一个新的限制性酶切位点，而不必考虑该位置的遗传密码。随后可将此质粒作为模板，用于一系列新的突变实验，通过引入新的诱变引物将该限制性酶切位点删除。如果计划在同一质粒位点进行一系列突变，这种方法将非常便捷

DNA聚合酶： 本方法需要一种具有3’–5’外切核酸酶活性并能产生平末端的耐热DNA聚合酶。我们始终使用来自Fermentas的重组Pfu聚合酶。如果扩增步骤出现问题，可尝试使用更高品质的聚合酶，但对于大多数用途，标准的Pfu聚合酶已足够。用dNTPs、聚合酶缓冲液和水完成反应体系。

1.2 热循环条件

PCR仪的设置方式如下：初始及循环变性阶段设置为95°C下30秒。

引物的退火温度无需通过复杂公式计算。我们通常将退火温度设为55°C，退火时间为1分钟。对于大多数情况下使用的25至30个核苷酸长度的引物，该条件在95%的情况下均适用。如果此条件不适用，只需尝试将退火温度在50–60°C之间进行调整即可。

延伸温度取决于所使用的聚合酶。本实验中我们使用费门塔斯（Fermentas）提供的Pfu聚合酶，其推荐的延伸温度为72°C。延伸时间根据质粒的大小而变化。我们通常按每千碱基对（kb）1分钟计算，并额外增加1分钟。例如，对于一个9 kb的质粒，我们选择10分钟作为延伸时间。

18 个循环足以产生可用于后续实验的突变质粒。保持较低的循环次数也能节省时间。

1.3 热循环反应后的凝胶检测

应通过电泳检测扩增是否成功。循环结束后，立即取5 µl反应产物上样至1% TAE琼脂糖凝胶。如果扩增成功，应能观察到一条清晰的条带。但如果新合成的DNA在凝胶上不明显，可尝试将整个反应体系沉淀后用于下一步的转化。此方法对我们而言很少成功，但值得尝试。若反应失败，最佳解决方法是调整退火温度。

1.4 DpnI 消化：

在转化之前，必须从反应体系中去除作为模板的原始质粒，以防止产生强背景信号。这一步通过使用 DpnI 进行限制性消化来实现。该限制性内切酶仅切割甲基化的质粒。其识别和切割位点为 GATC 序列，其中 A 必须被甲基化。当使用 DpnI 消化时，只有从 dam+ 菌株中分离得到的、未突变的原始质粒会被切割，而新合成的、未甲基化的突变质粒则不受 DpnI 影响。只需向反应体系中加入 1–2 µl DpnI，并在 37°C 下孵育至少一小时。若使用 Fast Digest DpnI，则孵育时间可缩短至约 15 分钟。DpnI 酶的质量以及该限制性消化的孵育时间，将极大程度地决定未突变质粒背景信号的强弱。

1.5 转化：

DpnI 消化后，质粒即可用于转化感受态 E. coli 细胞。只需将 5 µl DpnI 消化反应产物加入感受态细胞中，并按照实验室常规推荐的方法进行转化。在本实验中，我们采用热激法：将细菌与质粒的混合物在冰上孵育 30 分钟，然后在 42°C 下热激 90 秒。加入 200 µl SOC 溶液后，将细菌在 37°C 下剧烈振荡孵育 1 小时。孵育 1 小时后，将细菌涂布于选择性琼脂培养基上。

2.0 第二天

2.1 克隆筛选第一部分：克隆的筛选

由于突变效率并非100%，因此需要对突变体进行筛选。我们通过限制性酶切来实现这一目的，即检测因引物整合而引入或消除的限制性酶切位点是否存在。为此，我们通常挑选八个菌落，过夜培养，以便在次日进行质粒提取。

3.0 第三天

3.1 克隆筛选第二部分：使用标记酶进行限制性消化

第三天进行小量质粒提取，并使用标记酶进行后续的限制性酶切。通过凝胶电泳即可判断哪些克隆携带目标突变，哪些没有。

利用限制性酶切进行筛选的方法效果很好。然而，您应通过测序确认突变是否成功。

讨论

定点突变是一种能够快速突变质粒所携带基因的诱变方法。整个反应仅需一天即可完成。该方法仅需要一对携带目标突变的互补引物以及一种具有校对功能的DNA聚合酶（如Pfu聚合酶）。新合成的质粒可通过DpnI限制性内切酶消化反应产物，从而与亲本质粒分离。该酶仅消化甲基化的DNA，因此只有新合成的质粒可被转化。在本教程中，我们展示了使用自制的定点突变试剂盒进行该操作的过程。该试剂盒的优势在于节约成本的同时仍保持有效性。该方法的关键环节在于引物设计和退火温度的控制。若在电泳后无法观察到新合成的DNA，可能表明实验失败，此时可尝试将整个反应体系沉淀后直接用于细菌转化。但解决该问题的最佳方法是优化退火温度，或增加引物中恒定区域的长度。此外，使用高质量的聚合酶或限制性内切酶也可能提高反应的灵敏度。感受态细胞同样是影响该方法成功与否的关键因素，因此建议使用中等（10⁷ cfu/µg DNA）或高感受态（10⁹ cfu/µg DNA）的细胞。

尽管在本教程中我们未使用自制试剂盒展示删除或插入操作，但在我们的实验室中已成功实现这些操作。我们能够同时成功替换、插入或删除至少3个碱基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Pfu 聚合酶（重组型或天然型）	Fermentas	EP0571 或 EP0501
dNTP 混合物 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI 或 DpnI 快速限制性内切酶	Fermentas	ER1701
引物	Invitrogen		脱盐处理