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方法文章

离体灌注大鼠心脏的光学标测

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DOI：

10.3791/1138

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2009年8月11日

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Children's Hospital Boston and Harvard Medical School, 2Departments of Cardiac Surgery, Children's Hospital Boston and Harvard Medical School

本文内容

摘要

本文介绍了一种高时间和空间分辨率的技术，利用电位敏感染料（di-8-ANEPPS）对离体灌注的大鼠心脏表面动作电位的传播进行光学成像。

摘要

使用电压敏感性荧光染料对心脏表面进行光学标测，已成为研究从细胞培养到完整器官等不同尺度实验模型中电兴奋活动的重要工具[1, 2]. 利用先进的光学成像系统，几乎可以实时可视化正常心律期间或心律失常发生与维持过程中动作电位的产生与传播[1]. 最新上市的商用系统能够提供极高的时空分辨率信息，这些系统最初是基于自行构建的设备开发的，旨在克服传统电生理学方法所带来的局限性[1]. 高分辨率和高速互补金属氧化物半导体（CMOS）相机、高亮度发光二极管（LED）、电压敏感染料、光学元件及滤光片的不断进步，已使电生理信号的采集对更习惯使用显微镜的心血管细胞生物学家而言变得切实可行。尽管最新一代的CMOS相机可在16,384像素阵列上实现每秒10,000帧的采集速度，但根据样本制备类型的不同，已广泛应用的荧光信号采集技术（如光电二极管阵列、激光扫描系统和冷却电荷耦合器件（CCD）相机）在动态范围、信噪比和量子效率方面仍具有一些明显优势。[1, 3]. 在本研究中，大鼠心脏被灌注ex vivo使用改良的Langendorff装置，以37°C的晶体灌注液（Krebs-Henseleit溶液）进行灌注。经过20分钟的稳定期后，心脏间歇性地灌注11 mmol/L的2,3-丁二酮单肟，以消除图像采集期间与收缩相关的心肌运动。对于光学标测，我们用心肌细胞膜电位快速响应探针di-8-ANEPPS对心脏进行负载。[4] （5 μMol/L）并用475±15 nm激发光短暂照射样本。在典型的2秒照射期间， >使用连接至水平体视显微镜的高速CMOS相机采集离体心脏标本发出的605 nm光信号。在本演示中，通过连接至独立电刺激仪的同轴电极以300次/分钟的频率起搏心脏。同步获取双极心电图记录，并与电压信号一起使用常规软件进行分析。通过该方法，可对Langendorff灌注大鼠心脏表面的动作电位进行可视化观察，并与心电图信号同步记录。

方案

第1部分：配制溶液及准备离体灌流心脏系统

  1. 实验当天早晨，按先前所述方法配制 4.0 L 的 Krebs-Henseleit 溶液[5, 6]。
  2. 将 11 mMol/L 的 2,3-丁二酮单肟（BDM）溶解于步骤 1.1 中配制的灌流液分装出的 1.0 L Krebs-Henseleit 溶液中。
  3. 从步骤 1.1 配制的灌流液中另取出 150 mL，与 5 Mol/L 的 di-8-ANEPPS（用二甲基亚砜（DMSO）稀释自 10 mMol/L 储存液）混合。
  4. 将上述三种溶液转移至带水套的玻璃储液瓶（Radnoti）中，预热至 41.0°C，并使用浸入式鼓泡器（Radnoti）以经 0.2 μm 滤膜过滤的 95% O2 和 5% CO2 混合气体进行氧合。三种储备液通过 MasterFlex™ L/S 蠕动泵和低吸附性硅胶管（Cole-Parmer）输送至壁挂式 Langendorff 系统。
  5. 在组装前，Langendorff 系统的玻璃器皿（Radnoti）需用 E-TOXA-CLEAN 试剂（Sigma-Aldrich）仔细清洗，并依次用 0.1 M/L HCl、100% 乙醇和蒸馏水充分冲洗。
  6. 该非循环 Langendorff 装置设计为从三个独立的氧合储液瓶提供 70 mm Hg 的恒定压力，储液瓶与心脏之间设有带水套的加热线圈和气泡捕获装置（Radnoti）[7]。三条独立的灌注管路在心脏上方通过两个三通旋塞汇合，使我们能够精确控制步骤 1.1 至 1.3 所配制溶液的输送。带水套的玻璃器皿通过 MasterFlex PharMed BPT 管路（Cole-Parmer）串联连接，并利用两台 E100 循环水浴（Lauda）以蒸馏水加热至 39°C。由于连接压力储液瓶与加热线圈及气泡捕获装置的铂固化硅胶管（Cole-Parmer）存在热量散失，最终到达心脏的灌流液温度为 37°C。

第二部分：收获大鼠心脏并建立兰格多夫灌流

  1. 为对体重200-250 g的Lewis大鼠诱导深度全身麻醉，需向腹腔内注射100 mg/kg氯胺酮（Ketamine）和10 mg/kg赛拉嗪（Xylazine）。在此混合液中加入500 U/kg肝素（Heparin），以防止摘取器官过程中发生血液凝固和心肌缺血。
  2. 为便于暴露心脏及大血管，需切除前胸壁。随后仔细分离周围组织，并打开心包囊。
  3. 确认下腔静脉后，用5-0丝线（Ethicon）结扎该血管，并完整摘取心脏-肺组织块。立即将组织置于盛有冰冻Krebs-Henseleit溶液的50 mL烧杯中，烧杯置于冰上。
  4. 迅速识别并分离升主动脉，将合适尺寸的套管（Harvard Apparatus）插入主动脉，注意避免因插入过深而阻断冠状动脉的必要灌注。用5-0丝线（Ethicon）将套管固定于升主动脉。
  5. 将大鼠心脏置于Langendorff装置上，注意避免向套管内引入气泡。利用步骤1.6中所述压力源提供的温热且含氧的Krebs-Henseleit溶液，开始逆向冠状血管灌注。
  6. 去除包括肺在内的多余组织，心脏继续灌注20分钟，以恢复其功能并稳定心律。在此期间，将一根极细的热电偶温度探针（Cole-Parmer）插入左心室腔内，并用5-0 Prolene缝线（Ethicon）缝合固定。将探针连接至温控仪（Digi-Sense），通过调节循环水泵的设置，确保心脏温度维持在37°C。在流出液收集容器中放置一块纱布，以减少心尖滴液引起的运动干扰。

第3部分：用心电位敏感染料负载心脏并获取电图和光学信号

  1. Di-8-ANEPPS（Invitrogen）通过三通阀切换至含有荧光染料与Krebs-Henseleit溶液混合液的灌注管路，从而加载至心脏。此外，将18G套管插入左和/或右心房，并向每个心房腔室缓慢注入额外50 mL染料溶液，因为经冠状动脉灌注的染料无法充分灌注这些腔室。
  2. 在加载过程中，将3个心电图导联（Harvard Apparatus）轻轻放置于心脏表面不朝向映射所用光学系统的一侧。电极No 1 位于左心室的后顶部，No 左心房上的2和No 3 作为主动脉根部的参考电极（图1）。心房和心室的电图信号随后通过软件（RedShirt Imaging）进行放大、数字化，并与光学信号一同显示（图2）。同时使用示波器（Tektronix 型号 TDS 1002）实时观察体表心电图，以确保起搏效果适当。
  3. ECG 放大器（Hugo Sachs Elektronik）设置： 高通滤波器：0.1 Hz
    低通滤波器：150 Hz
  4. 使用X-Y-Z调节装置调整CMOS相机（RedShirt Imaging）和宏观成像系统的位置，使心脏表面在采集画面中清晰对焦并居中。相机与光学系统安装在减震台（Minus K Technology）上，以最大限度减少共振频率的影响。同时，将一根同轴起搏电极（Harvard Apparatus）连接至隔离式S48电刺激仪（Grass），放置于右心房，并以每分钟300次的频率进行心脏起搏（图1）。
  5. 电刺激（Grass）设置：
    频率：每秒5次脉冲
    延迟：0.2 ms
    持续时间：2 ms
    电压：6-12 V
    模式：重复
    脉冲：单次
  6. 为了获得无收缩运动伪影的光学记录，需要将心脏进行电-机械去耦联。我们通过再次切换灌注管路至含有11 mmol/L BDM的Krebs-Henseleit溶液来实现这一操作。在各次数据采集之间，使用未经添加物的Krebs-Henseleit溶液灌注心脏，以帮助维持组织的活性。
  7. 使用软件（RedShirt Imaging）设置以下采集参数：
    配置：2,000 Hz；128×128 像素阵列
    帧间隔：0.5 ms
    相机放大器增益：5倍
    片上增益：8x-12Me-阱
    快门：500 毫秒延迟
    帧数：4000
    持续时间：2000 ms
  8. 关闭或遮蔽所有房间和设备的光源，以消除记录过程中的背景噪声。LED光源仅在光学记录期间照射心脏，以减少光漂白和染料毒性。光源快门通过计算机中的D/A板（RedShirt Imaging）经由控制面板输出5 V脉冲进行控制。

第4部分：使用RedShirt Imaging软件分析采集信息

  1. 采集完成后，使用不同的滤波设置对数据进行处理。通常使用默认设置，仅在调整带阻/带通滤波器时例外，此时将左边界设为 44.0，右边界设为 98.0。随后对记录的信息进行处理，并生成视频（RedShirt Imaging）。
  2. 一次采集的数据对应于心脏表面 16,384 个位点在 2 秒时间内的局部电激活情况。该软件可将这些局部信号相互直接比较，并与心房和心室的心电图记录进行比较。然后通过将局部电激活映射为颜色，并将此信息渲染为动画，以显示心脏表面的时空电激活过程。为生成此类动画，我们使用软件进行以下操作：
    • 对数据进行时间上和/或空间上的滤波
    • 选择动画的起始和结束时间
    • 根据每个像素的静息光强度将光信号映射为颜色
    • 将生成的颜色数据与心脏图像叠加
    • 生成动画

第5部分：代表性结果

如果在记录期间灌注心脏制备物保持静止，则每个参与di-8-ANEPPS发射光强度变化的像素所对应的光学信号均显示一个明显的单峰。相应的视频（图3和图4）展示了兴奋波在心脏心外膜表面的传播，以及同步采集的心电图记录（图2）。

用于心脏起搏研究的朗根多夫心脏装置示意图，突出显示编号的组件。
图 1. 一幅朗根多夫灌注心脏制备的照片，显示了步骤 3.2 中所述的位于右心房的起搏电极和心电图导联的位置。

显示信号的生物过程示意图；荧光显微镜结果的数据分析。
图 2. 来自灌注的Lewis大鼠心脏的代表性光学信号与电图记录。图A显示用于光学成像的心外膜表面图像。图B中用彩色箭头标示了用于展示荧光发射随时间变化的像素位置。图C显示电图信号，其中红线表示心房激活，浅蓝色线对应心室信号。请点击此处查看该图的放大版本。

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讨论

从麻醉大鼠体内取出心脏必须迅速进行，以避免心肌缺血。如果发生缺血或冠状动脉灌注不足，心脏很可能出现心律失常，并可能发生梗死。此外，这些心脏将表现出荧光发射不足，无法获得可用于有效记录和后续分析的数据。在加载染料之前，必须用心肌细胞充分灌注Krebs-Henseleit溶液，以建立并维持生理电解质环境，从而保证电冲动的稳定性。准确配制灌流液对于维持器官的正常存活性和功能也十分必要。灌流液中电解质浓度的差异或过滤不充分，均可能导致致命的心肌功能障碍和心律失常。对于光学记录，心脏必须完全负载电压敏感性染料。这一点对于心房心肌尤为重要，因为这些腔室的冠状动脉灌注较差。我们发现，对心房进行额外的腔内灌注可获得良好的光学信号。此外，要获取高质量的电压追踪信号，灌流心脏必须保持静止；否则，由于信号漂移引起的人工伪影，荧光发射的变化将无法可靠地高保真反映膜电位的变化，这会导致单个像素出现多个峰，而非单一峰。其他消除光学记录中运动伪影的方法包括机械固定、使用其他兴奋-收缩解偶联剂（如细胞松弛素D、blebbistatin）、信号处理以及数学建模[1, 8]。最后，本文所述方法仅提供有关动作电位在心脏心外膜表面传导的信息。其他组织制备...

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披露

动物实验严格按照波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院的研究基金（HL068915；HL088206）以及波士顿儿童医院心脏传导基金的捐款资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CardioCMOS-SM128f设备RedShirtImaging, LLC
CardioPlex 软件设备RedShirtImaging, LLC
LUXEON LED 光源 460-490 nm 设备Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USALXHL-PB02
ECG 放大器 Type 689 Hugo Sachs Elektronik设备哈佛仪器公司730149
505 nm 二向色镜设备SemrockFF505-SDi01-25x36
605 nm 长通发射滤光片设备SciMedia
THT 侧向支架设备SciMedia25 BM-8
微型球形关节支架设备哈佛仪器公司BS4 73-0177
小型刺激电极组设备哈佛仪器公司BS4 73-0160
BM-6 台式振动隔离平台设备Technology Inc., Inglewood, CA 9030125 BM-6
单极 ECG 电极设备哈佛仪器公司BS4 73-0200
滚轮泵 SCI 400设备Watson-Marlow 泵业集团401U/D1
滚轮泵 MasterFlex Easy Load II设备Cole-Parmer型号 77201-60
Marprene #14 管路设备Watson-Marlow 泵业集团902.0016.016
MasterFlex 管路设备PharMed, Westlake, OH 44145 USA06485-25
S48 方波脉冲刺激器设备Grass Technologies型号 S48
SIU5 射频变压器隔离单元设备Grass Technologies型号 SIU5
5 升水套式储液槽设备Radnoti Glass Technology Inc.120142-5
2 升水套式储液槽设备Radnoti Glass Technology Inc.120142-2
0.5 升水套式储液槽设备Radnoti Glass Technology Inc.120142-0
0.25 升水套式储液槽设备Radnoti Glass Technology Inc.120142-025
10 ml 加热盘管设备Radnoti Glass Technology Inc.158822
顺应性气泡捕获器设备Radnoti Glass Technology Inc.130149
Luer 断开式套管设备哈佛仪器公司72-1444
三通止流阀，FLL 转 MLT，无端口盖设备哈佛仪器公司BS4 72-2630
热电偶温度计设备Cole-ParmerWU-91100-40
Ultra Fine IT 系列柔性微探针设备PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USAIT-24P
示波器 Tektronix TDS 1002设备Tektronix, Inc.TDS 1002B
2,3-丁二酮单肟试剂Sigma-AldrichB0753
盐酸氯胺酮试剂Hospira Inc.RL-0065
赛拉嗪试剂Lloyd, Inc.LB15705A
E-TOXA-CLEAN®试剂Sigma-AldrichE9029
Di-8-ANEPPS试剂InvitrogenD-3167

参考文献

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
  2. Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
  3. Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
  4. Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
  5. Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
  6. Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
  7. Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  8. Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).

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