活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。
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摘要
摘要
观察和表征细胞内的动态过程可提供静态图像无法获得的重要细胞活动信息。活细胞荧光探针，尤其是绿色荧光蛋白（GFP），因其能够标记特定的细胞内区室和细胞结构，已彻底改变了细胞生物学研究。例如，通过活体成像GFP（及其光谱变体）融合蛋白，研究人员已在多种生物体和细胞类型中实现了对细胞骨架、细胞器运输以及膜动力学的动态分析[1-3]。尽管活体成像技术已广泛应用，但该方法仍面临诸多技术挑战，尤其是在原代培养神经元中。其中两大挑战分别为：在终末分化神经元中表达GFP标记蛋白，以及在最小化光毒性、光漂白并维持细胞整体健康状态的前提下获取荧光图像。本文提供了一种基于脂质体的转染方法，其转染效率相对较低（约0.5%），但非常适合用于完全极化神经元的成像研究。低转染率至关重要，以便能够清晰分辨单个轴突和树突相对于胞体的取向，从而确认运输方向（顺向运输与逆向运输）。我们对表达GFP神经元的成像方法依赖于配备CCD相机、图像采集软件和加热成像腔的标准宽场荧光显微镜。我们已成功对多种细胞器或结构进行了成像，例如致密核心囊泡、线粒体、生长锥和肌动蛋白，仅需荧光光源，无需特殊光学装置或激发条件。此外，还可近乎同时观察光谱上可区分的荧光标记蛋白（如GFP与dsRed标记蛋白），以表征共运输或其他协调性细胞事件。本文所述成像方法灵活适用于多种成像应用，只要实验室具备显微镜设备，即可以较低成本建立该系统。
关键词：活体成像，绿色荧光蛋白，GFP，原代神经元，脂质体转染，细胞器运输，轴突运输，宽场荧光显微镜，光毒性，光漂白，中国台湾
方案
第1部分：使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染神经元
仪器设置：
大鼠或小鼠海马神经元的培养参照 Kaech 和 Banker（2006）[4] 的方法进行。转染实验常用的细胞密度为 250,000 个细胞/6 cm 培养皿。所需试剂与设备包括 50 mM 犬尿烯酸、常规台式试管架、台式冷却器（建议保持 Lipofectamine 试剂低温）、
Lipofectamine 试剂、MEM 培养基、微量离心管、移液器以及无菌镊子。
实验步骤：
- 每次转染时标记两个1.5 mL离心管：一个用于盛装质粒DNA，另一个用于盛装转染试剂。以下孵育步骤可在室温下进行。
- 在一个离心管中将1.0 μg质粒DNA与100 μL MEM混合（不添加任何补充物；MEM无需预先调节温度或pH平衡）。
- 在另一个1.5 mL离心管中将6.0 μL Lipofectamine与100 μL MEM混合。
- 即使在双质粒共转染的情况下Lipofectamine:DNA比例会减半，也无需调整用量。此时Lipofectamine:DNA比例仍在生产商建议范围内。建议对每种质粒分别测试0.5–1.0 μg以获得最佳表达效果。
- 为延长Lipofectamine试剂的保存期限，应尽量缩短其从冰箱中取出的时间，并在不使用时置于台面冷却器中。
总暴露于室温的时间应尽可能缩短。
- 将离心管在室温下孵育5分钟。
- 将DNA-MEM溶液转移至脂质体管中，用移液器轻轻混匀，然后在室温下孵育30分钟。
- 在25分钟后、翻转盖玻片前，加入60 μL 50 mM犬尿烯酸，以最大程度减少对培养神经元的兴奋性毒性损伤。
- 使用无菌镊子小心地将盖玻片翻转为“脚面”朝上，并排列整齐避免重叠。注意不要刮擦盖玻片上的神经元涂层表面或培养皿上的胶质细胞涂层表面。
- 从6 cm培养皿中取出约0.5 mL培养基，轻轻与离心管中的DNA溶液混合，然后将DNA溶液重新滴加回培养皿中，均匀分布在培养基表面。
- 不要振荡，而是轻轻地沿一个方向前后滑动培养皿，停止后换垂直方向重复滑动，以均匀分散DNA-Lipofectamine复合物。随后在组织培养孵箱中孵育90分钟（37°C，5% CO2）。
- 将盖玻片翻转为“脚面”朝下，并排列整齐避免重叠。继续培养至所需表达时间，通常为过夜至48小时。
第二部分：培养的海马神经元中GFP标记的致密核心囊泡的活体成像
仪器设置：
- 活细胞成像需要配备CCD相机的荧光显微镜；我们使用的是Leica DMI 6000B倒置显微镜，并配备Leica可变荧光灯。此外还需要带有温度控制器的成像腔室和物镜加热器。我们使用Warner Instruments RC-21BR腔室（适配18 mm盖玻片），并搭配平台加热器（货号 #PH2）和温度控制器（货号 #TC324B）。该腔室无开放端口，此改装可在订购时注明。强烈建议使用物镜加热器，以帮助维持盖玻片温度，减少因温度波动引起的焦距变化。图像采集使用Hamamatsu Orca-ER相机，并通过Metamorph（Molecular Devices）软件进行，包括其“流式”采集模式插件。注意：我们不使用包裹整个显微镜的气候腔室。这种设备成本较高，对于此处描述的短期成像而言并非必要。
- 其他设备和试剂包括新配制的活细胞成像培养基（1× Hank's缓冲液含Ca2+和Mg2+、0.6%葡萄糖和10 mM HEPES）、额外的18 mm玻璃盖玻片、无菌镊子、非无菌镊子、Kimwipes纸巾、真空脂，以及用于涂抹油脂的注射器（无针头或配有改装的宽口针头）。
实验步骤：
- 配制新鲜的活细胞成像培养基（1× Hank's 溶液，含 Ca2+ 和 Mg2+，0.6% 葡萄糖，10 mM HEPES）。我们通常每次配制 50 mL，不使用时储存于 4oC。建议每次配制量不超过一周用量。每皿神经元大约使用 5–10 mL。
- 启动显微镜、相机、荧光灯及图像采集软件。同时打开腔室平台和物镜加热器的电源。
- 准备成像腔室。
- Warner 腔室包含一个用于固定盖玻片的聚四氟乙烯（Teflon）插件。为便于操作，可用永久性记号笔在插件一侧标记“top”（顶部）。
- 在腔室侧面标有“top”（顶部）的孔周围凹槽处涂抹一圈真空脂。注意避免使用过量，否则真空脂会进入腔室内部，减少可观测区域。
- 使用镊子将一块洁净、未使用过的 18 mm 盖玻片固定在腔室的“top”（顶部）侧，轻轻按压盖玻片边缘，使其在腔室的凹槽内形成严密密封。
- 将腔室翻转，于另一侧（底部）的凹槽处同样涂抹一圈真空脂。
- 将已准备好的腔室（底部朝上）放置在 50 mL 离心管的管盖上，该管盖是理想的腔室支架。
- 向腔室内加入 750 μL 成像培养基。此量略多，但由于真空脂的密封作用，培养基不会溢出，且多余液体有助于在放置细胞覆盖的盖玻片时防止气泡滞留。
- 将准备好的腔室置于细胞培养孵箱中备用。应避免长时间孵育（约 1 小时以上），以免成像培养基蒸发并发生成分改变。
- 进行最终腔室组装及活细胞成像。
- 将准备好的腔室和一皿转染后的盖玻片从孵箱转移至细胞培养超净台中。
- 最终的腔室组装应迅速完成，以确保细胞持续浸没在培养基中并维持在 37°C。
- 使用无菌镊子小心地从转染后的培养皿中取出一张盖玻片，用 Kimwipe 纸轻触其边缘，吸除生长培养基。
- 将盖玻片有细胞的一面朝下放置在已准备好的腔室上。先将盖玻片一侧接触真空脂，然后沿边缘施加轻压，使盖玻片平整贴合，避免夹入气泡。多余的成像培养基会自然溢出，属正常现象。
- 擦去多余的成像培养基，但注意不要移动盖玻片位置。
- 将腔室转移至预热的平台加热器上，并固定腔室。
- 将腔室移至显微镜载物台上。
- 为减少光漂白和光毒性，将光源强度调节至能够定位转染细胞的最低必要水平。
- 使用低倍油镜（40X）寻找目标细胞。建议采用固定的搜索模式，以确保盖玻片区域被充分覆盖，并避免重复采集图像，例如从盖玻片左上角开始，自上而下逐行向右扫描。
- 在找到合适视野后，切换至高倍油镜（60–100X）。
- 使用成像软件的“实时采集”（stream acquisition）或类似功能，记录荧光标记蛋白动态变化的视频。
- 采集相差图像及其他辅助图像（如可溶性 GFP），用于后续分析和展示。
- 在继续探索盖玻片其他区域并录制下一个视频前，保存所有图像。
- 通常，从一张盖玻片获得 3–5 段视频即视为成功。需始终关注光毒性和细胞整体健康状况，因受损细胞的运输活动会减弱。可通过相差显微镜观察监测细胞状态。通常每张盖玻片的记录时间约为 30 分钟。
第3部分：代表性结果：
活细胞成像观察通常包括显示视野内荧光标记细胞器运动的视频（也称为“图像序列”或“图像堆栈”）（图1A）。每个视频通常附有辅助图像，用于说明视野相对于细胞体的方位、蛋白表达水平和/或细胞的健康状态。运输过程的视频可通过转换为显微轨迹图（kymograph）进行定量分析（图1B）。显微轨迹图是通过并列线扫描生成的图像，其中每个时间点在显微轨迹图中以一列形式呈现。图2展示了两个朝相反方向运动的颗粒在显微轨迹图中的表现形式。对显微轨迹图的进一步分析可提供有关颗粒流量、速度、运行长度、运动方向逆转以及静止颗粒的信息。
图1. 活细胞成像的代表性观察结果。(A) 组织型纤溶酶原激活物（TPA）运输视频中选取的帧图像。图中显示了沿顺向（绿色箭头）和逆向（红色箭头）移动的单个颗粒。(B) 显示轴突中TPA-mCherry运动的线扫图。线扫图中的水平线代表静止的物体，而斜线代表远离（正斜率）或朝向（负斜率）胞体运动的细胞器。长的绿色和红色箭头显示了与(A)中颗粒相对应的运动轨迹。同时通过线扫图展示了微管去聚合试剂诺考达唑对运输造成的影响。注意由于斜线减少，运动中的细胞器数量明显下降。
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讨论
活细胞成像是直接观察培养神经元中细胞器运输的一种具有挑战性但功能强大的技术。在实验操作之前，由于培养过程中可能出现问题，导致神经元状态不佳，从而引发困难。因此，应在转染前后通过倒置显微镜在生长培养基中观察盖玻片，评估细胞状态（示例参见参考文献4）。将含有神经元的盖玻片转移至成像腔的过程可能对细胞造成应激，因此在操作盖玻片时必须格外小心。即使细胞外观健康，也可能因操作过程延迟、设备预热不充分或成像培养基未充分平衡而出现无运输现象。进行运输分析时，必须明确轴突和树突的方向，即区分顺向运输与逆向运输。因此，必须准确确定细胞体的位置，并能观察到从感兴趣区域连续延伸至细胞体的神经元区段。通常，保存可溶性GFP的重叠图像，或对保存的视频文件进行信息性命名，即可确定用于分析的细胞过程方向，例如“Cell1CellBodyUpperLeft”。
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致谢
感谢Harald Hutter和Helena Decker对本文稿的仔细审阅。同时感谢Leica Microsystems的Reg Sidhu提供的专业技术支持。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（资助号：#327100-06）以及西蒙菲莎大学理学院的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 含Earle盐和L-谷氨酰胺的MEM-Eagle培养基 | 试剂 | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | 试剂 | Invitrogen | 11668-027 | 转染试剂 |
| 含Ca²⁺和Mg²⁺的10X Hanks溶液 | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | 活细胞成像培养基 |
| 1M HEPES | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | 活细胞成像培养基 |
参考文献
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 1/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
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