活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。
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摘要
摘要
观察和表征细胞内的动态过程可提供静态图像无法获得的重要细胞活动信息。活细胞荧光探针，尤其是绿色荧光蛋白（GFP），因其能够标记特定的细胞内区室和细胞结构，已彻底改变了细胞生物学研究。例如，通过活体成像GFP（及其光谱变体）融合蛋白，研究人员已在多种生物体和细胞类型中实现了对细胞骨架、细胞器运输以及膜动力学的动态分析[1-3]。尽管活体成像技术已广泛应用，但该方法仍面临诸多技术挑战，尤其是在原代培养神经元中。其中两大挑战分别为：在终末分化神经元中表达GFP标记蛋白，以及在最小化光毒性、光漂白并维持细胞整体健康状态的前提下获取荧光图像。本文提供了一种基于脂质体的转染方法，其转染效率相对较低（约0.5%），但非常适合用于完全极化神经元的成像研究。低转染率至关重要，以便能够清晰分辨单个轴突和树突相对于胞体的取向，从而确认运输方向（顺向运输与逆向运输）。我们对表达GFP神经元的成像方法依赖于配备CCD相机、图像采集软件和加热成像腔的标准宽场荧光显微镜。我们已成功对多种细胞器或结构进行了成像，例如致密核心囊泡、线粒体、生长锥和肌动蛋白，仅需荧光光源，无需特殊光学装置或激发条件。此外，还可近乎同时观察光谱上可区分的荧光标记蛋白（如GFP与dsRed标记蛋白），以表征共运输或其他协调性细胞事件。本文所述成像方法灵活适用于多种成像应用，只要实验室具备显微镜设备，即可以较低成本建立该系统。
关键词：活体成像，绿色荧光蛋白，GFP，原代神经元，脂质体转染，细胞器运输，轴突运输，宽场荧光显微镜，光毒性，光漂白，中国台湾
方案
第1部分：使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染神经元
仪器设置：
大鼠或小鼠海马神经元的培养参照 Kaech 和 Banker（2006）[4] 的方法进行。转染实验常用的细胞密度为 250,000 个细胞/6 cm 培养皿。所需试剂与设备包括 50 mM 犬尿烯酸、常规台式试管架、台式冷却器（建议保持 Lipofectamine 试剂低温）、
Lipofectamine 试剂、MEM 培养基、微量离心管、移液器以及无菌镊子。
实验步骤：
- 每次转染时标记两个1.5 mL离心管：一个用于盛装质粒DNA，另一个用于盛装转染试剂。以下孵育步骤可在室温下进行。
- 在一个离心管中将1.0 μg质粒DNA与100 μL MEM混合（不添加任何补充物；MEM无需预先调节温度或pH平衡）。
- 在另一个1.5 mL离心管中将6.0 μL Lipofectamine与100 μL MEM混合。
- 即使在双质粒共转染的情况下Lipofectamine:DNA比例会减半，也无需调整用量。此时Lipofectamine:DNA比例仍在生产商建议范围内。建议对每种质粒分别测试0.5–1.0 μg以获得最佳表达效果。
- 为延长Lipofectamine试剂的....
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讨论
活细胞成像是直接观察培养神经元中细胞器运输的一种具有挑战性但功能强大的技术。在实验操作之前，由于培养过程中可能出现问题，导致神经元状态不佳，从而引发困难。因此，应在转染前后通过倒置显微镜在生长培养基中观察盖玻片，评估细胞状态（示例参见参考文献4）。将含有神经元的盖玻片转移至成像腔的过程可能对细胞造成应激，因此在操作盖玻片时必须格外小心。即使细胞外观健康，也可能因操作过程延迟、设备预热不充分或成像培养基未充分平衡而出现无运输现象。进行运输分析时，必须明确轴突和树突的方向，即区分顺向运输与逆向运输。因此，必须准确确定细胞体的位置，并能观察到从感兴趣区域连续延伸至细胞体的神经元区段。通常，保存可溶性GFP的重叠图像，或对保存的视频文件进行信息性命名，即可确定用于分析的细胞过程方向，例如“Cell1CellBodyUpperLeft”。
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致谢
感谢Harald Hutter和Helena Decker对本文稿的仔细审阅。同时感谢Leica Microsystems的Reg Sidhu提供的专业技术支持。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（资助号：#327100-06）以及西蒙菲莎大学理学院的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 含Earle盐和L-谷氨酰胺的MEM-Eagle培养基 | 试剂 | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | 试剂 | Invitrogen | 11668-027 | 转染试剂 |
| 含Ca²⁺和Mg²⁺的10X Hanks溶液 | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | 活细胞成像培养基 |
| 1M HEPES | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | 活细胞成像培养基 |
参考文献
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective trans....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 1/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
