解剖酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）子囊

摘要

酵母细胞的显微操作对于减数分裂遗传分析或选择二倍体合子是必需的。这些显微操作通过解剖显微镜下的显微针来完成。显微针用于移动细胞，其操作由显微操作仪控制，显微操作仪具有不同程度的自动化功能。

摘要

酵母是一种高度易于操作的模式系统，被用于研究许多不同的细胞过程。常用的实验室菌株Saccharomyces cerevisiae以单倍体或二倍体状态存在。将两个单倍体的等位基因组合以及对基因组进行修饰的能力，需要通过产生和分离子囊来实现。单倍体细胞产生子囊的过程始于两种具有相容交配型的酵母单倍体菌株交配，形成二倍体菌株。这一过程可通过多种方式在固体培养基或液体培养基中完成。选择性培养基有利于二倍体菌株生长，而对任一单倍体菌株无促进作用，因此使用此类培养基筛选二倍体更为有利。随后将二倍体菌株置于营养贫乏的培养基中使其发生孢子形成，产生子囊，即由二倍体经减数分裂产生的四个单倍体子细胞组成的结构。将包含营养细胞和子囊的混合物用酶解离酶（zymolyase）处理，以降解包裹子囊孢子的膜囊。在解剖显微镜下利用微操作仪和微针，可挑取单个子囊，并将其中的四个子囊孢子分离并移至新的位置。分离后的子囊需培养数天，再通过影印平板法转移到相应的选择性培养基上，检测目标标记基因或等位基因。

方案

二倍体菌株的构建
通过交配法生产二倍体的实验方案

1. 初始菌株应在 YPD 培养基或必要时在选择性培养基上划线，以获得单菌落。两个单倍体菌株应具有相反的交配型（即 MATa 和 MATα）。
2. 使用无菌接种环从两个单倍体菌株之一挑取少量菌落，在新的 YPD 平板上沿平板表面直线划线一次。在平板底部用箭头标记划线方向。
3. 在同一个 YPD 平板上对第二个菌株重复上述操作，此次划线方向应与第一次垂直，使第二条划线与第一条相交。标记第二条划线的方向，并注明两条划线交叉的区域。该交叉区域将是二倍体菌株产生的位置。
4. 将 YPD 平板在 30°C 下倒置培养过夜。
5. 将 YPD 平板上的菌落通过影印平板法转移至选择性培养基上，该培养基将选择性地允许新形成的二倍体菌株生长。
6. 尽可能挑取单个菌落，或挑取二倍体菌落划线中的少量部分，在相同的选择性培养基上划线以获得单菌落。

子囊的产孢与消化
实验方案

1. 从上述平板上挑取单菌落，在产孢（SPO）平板上制成小块（1 cm × 1 cm）菌苔，于30°C培养3–7天以诱导产孢。
2. 可通过光学显微镜检查各菌苔中的细胞来观察产孢情况。取5–10 μL水将细胞置于载玻片上，滴加盖玻片，观察是否存在子囊。若不易观察到子囊，则将平板放回培养箱继续培养。
3. 若某一菌苔中产孢效果良好，准备一支无菌15 mL锥形管，加入100 μL四分体裂解液（tetrad juice）。
4. 用无菌3 mm接种环从该产孢菌苔中挑取细胞（细胞量应覆盖接种环约1/4），转移至四分体裂解液中。轻轻旋转接种环，使细胞脱落并混入溶液中。
5. 在含有zymolyase的四分体裂解液中孵育4–10分钟（具体时间取决于zymolyase的浓度与活性以及菌株本身），以消化包裹子囊孢子的细胞壁。
6. 在YPD平板上标记接种区域的顶部和底部位置。
7. 可选步骤：可通过加入1 mL预冷的无菌dH₂O终止反应。静置5分钟使细胞沉淀，移除1 mL上清液，轻轻手动混匀后置于冰上保存。
8. 取5 μL步骤5中已消化的细胞，轻轻滴加成一条直线，置于预先标记的YPD平板接种区域内。
9. 用无菌3 mm接种环沿液滴线方向极轻地涂布1–3次，仅轻微接触琼脂表面。
10. 让液体充分渗入琼脂（若未执行步骤7，此时外层细胞壁的消化将减缓或停止）。随后进行显微解剖操作。

子囊的解剖
实验方案

请注意，以下方案是针对 Singer MSM System 200 显微操作仪进行描述的。若使用手动显微操作仪（如蔡司 Zeiss 显微操作仪 MR），可对本方案进行适当调整后参照执行。

1. 聚焦于培养皿中一半区域有细胞、另一半区域为空白的部位。缓慢调节针尖至焦平面，使其接触空白区域，以确保针尖未携带之前使用时残留的细胞。当针尖接触琼脂表面时，会呈现为一个逐渐清晰的深黑色圆圈。
2. 切换至A1位置的矩阵点，并再次刺穿琼脂做标记。此步骤有助于在显微镜中途取下培养皿后，仍能准确判断培养皿的方向。
3. 切换至搜索模式，寻找子囊（asci）。优先选择细胞分布均匀、分散良好的区域中的子囊，避免细胞成簇的区域。一个子囊中的四个子囊孢子应仍相互连接在一起，其中两个孢子可能略大于另外两个。应避免挑选其中有一个孢子已松动、脱离其他三个的子囊。
4. 用针尖拾取一个子囊。缓慢将针尖移向培养皿表面。当观察到微针的阴影时，将其与目标子囊对齐。继续推进针尖，直至看到一个黑色圆形轮廓（即针尖顶端）逐渐清晰。用该圆圈轻触四分体，然后迅速将针收回。确保来自同一子囊的四个子囊孢子全部粘附在针尖上，且微针未附带任何不属于该子囊的额外细胞。
5. 将微针移离培养皿较远位置，移至矩阵对应点（第一个子囊置于A1位置）。记录每一个子囊被转移后所放置的位置。通过将微针轻触培养皿表面后再迅速拉起，使四个子囊孢子完全脱离针尖。在此过程中，轻轻敲击针臂或承载YPD培养皿的平台通常有助于孢子脱落。
6. 重复步骤3至5，依次将子囊放置在矩阵的连续位置上，直至完成所需数量的子囊挑选。
7. 返回每个已放置的子囊，使用针尖轻轻拨动、轻敲平台，或结合两种方式，将四个孢子彼此分离。逐个拾取孢子，并将每个孢子移至矩阵中新位置，最终使每个子囊的四个孢子排列成四行独立的细胞列。
8. 将YPD培养皿置于30°C培养箱中培养数天，以观察其生长模式。
9. 如有需要，可将分离后的细胞通过影印法转移至选择性培养基上。

受精卵的移位
实验方案

1. 将两种交配型相反的单倍体菌株分别划线接种于合适的培养基上，以获得单菌落。
2. 按照上述方法使这两种菌株杂交，并培养4至6小时（必要时可过夜）。
3. 在光学显微镜下检查合子。合子呈哑铃形细胞，可能带有或不带有芽体。
4. 用3mm接种环挑取细胞（细胞量应覆盖接种环的1/4），轻轻放入100μL无菌dH₂O中。
5. 在YPD平板上标记接种区域的顶部和底部位置。
6. 取5μL菌液，轻轻滴加成一条线状，置于已标记的YPD平板的接种区域内。
7. 使用3mm接种环，在 barely 接触琼脂表面的情况下，非常轻柔地将液滴沿直线涂布。
8. 让液体完全渗入琼脂。随后转移至解剖显微镜下操作。
9. 聚焦于平板上一半视野有细胞、另一半无细胞的区域。缓慢调节针头焦点，使其接触视野中的空白区域，以确保针头未携带之前使用残留的细胞。针头与琼脂接触时会呈现为一个逐渐聚焦变清晰的深黑色圆圈。
10. 移至矩阵A1位置，再次刺穿琼脂做标记。此步骤有助于在显微镜操作中途取下平板后，重新放置时确定其方向。
11. 切换至搜索模式，定位一个合子。
12. 用针头挑取一个合子。
13. 将合子单独放置于矩阵的不同位置上。
14. 让合子生长数天。
15. 将合子通过影印法转移至相应的选择性培养基上。

代表性结果

图1： 两个不同交配型的单倍体菌株杂交产生一个二倍体菌株。

图 2：（A）YPD 平板，显示温度敏感型菌株（具有leu2营养缺陷型）与野生型菌株（LEU2）杂交的三个结果。消化后的细胞接种于左侧的接种区域，两条黑线之间可见浓密生长。右侧矩阵中为经过显微操作分离的子囊孢子，呈均匀分布。（B）将（A）中的平板复制到 SD -亮氨酸缺失培养基平板上。注意LEU2标记呈现 2:2 生长模式，表明已成功分离出有效的子囊孢子。（C）将（A）中的平板复制到 YPD 平板上，并在 37°C 下培养。注意仍呈现 2:2 生长模式，进一步验证了子囊孢子的正确分离。

讨论

酵母菌株分离是筛选具有特定标记新菌株的有效工具。在确定四个子囊孢子的理论生长模式时，需关注营养细胞的基因型。如果存在质粒，必须明确其为单拷贝、低拷贝还是高拷贝，因为这将影响哪些子囊孢子能够获得该质粒，进而影响对所操作菌株的预测与结论。

某些菌株比其他菌株更易产孢，在短时间内可产生大量子囊孢子。而其他菌株可能仅产生少量子囊孢子。只要能够挑选到足够数量的真正子囊，这对实验并无影响。此外，不同菌株在细胞壁消化过程中反应各异，因此有必要根据经验调整四分体裂解液中的孵育时间。

在筛选具有目标标记的细胞时，应仅选择那些来自子囊的细胞，其中所有子囊孢子的生长模式均与理论生长模式相符，并且显微分离过程中绝大多数子囊孢子均表现出预期的生长模式。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Singer MSM System 200	显微镜	Singer Instruments	NA
D-山梨醇	试剂	BioShop Canada	SOR508
Tris	试剂	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	试剂	Seikagaku Corporation	120493
酵母提取物	试剂	BioShop Canada	YEX401
蛋白胨	试剂	BioShop Canada	PEP 403
D-葡萄糖	试剂	BioShop Canada	GLU501
酵母氮源基础	试剂	BioShop Canada	YNB406
生物蛋白胨	试剂	BioShop Canada	TRP402
氯化钠	试剂	BioShop Canada	SOD002
乙酸钾	试剂	BioShop Canada	POA 301
琼脂	试剂	BioShop Canada	AGR003
硫酸腺嘌呤	试剂	BioShop Canada	ADS201
L-尿嘧啶	试剂	BioShop Canada	URA 241
L-色氨酸	试剂	BioShop Canada	TRP 100
L-组氨酸	试剂	BioShop Canada	HIS 200
L-精氨酸	试剂	Amresco	0877-100G
L-甲硫氨酸	试剂	BioShop Canada	MET 222
L-酪氨酸	试剂	BioShop Canada	TYR 333
L-异亮氨酸	试剂	BioShop Canada	ISO 910
L-缬氨酸	试剂	BioShop Canada	VAL 201
L-赖氨酸	试剂	BioShop Canada	LYS 101
L-苯丙氨酸	试剂	BioShop Canada	PHA 302
L-谷氨酸	试剂	BioShop Canada	GLU 202
L-苏氨酸	试剂	BioShop Canada	THR002
L-亮氨酸	试剂	BioShop Canada	LEU 222