大体积（20升以上）近海海水样品过滤

摘要

本视频记录了从水体中过滤微生物生物量的过程，过滤体积较大（≥20 L），微生物直径范围在0.22μm至2.7μm之间。

摘要

该流程始于沿海海水样品的采集，用于后续的微生物群落、营养盐和痕量气体分析。本方法中的样品采自位于萨尼奇湾运行的 HMS John Strickland 船只甲板。本视频记录了从水体中过滤获取直径介于 0.22 μm 至 2.7 μm 之间的微生物生物量（体积 ≥20 L）的操作过程。使用配备四个旋转头的单台泵装置可同时过滤两份 20 L 的样品。在长时间出海任务中，过滤操作于现场完成；而在单日往返任务中，则在返回后立即进行。记录通过每个 Sterivex 滤器单元的水量至关重要。为防止采样间隔期间形成生物膜，所有过滤设备在使用后必须立即用稀盐酸和去离子水冲洗，并进行高压灭菌。该过程约需 5 小时，另加 1 小时用于清理。

方案

1. 过滤装置的组装
   1. 组装过滤装置时，使用镊子将一张 GF/D 级滤膜放入预过滤器外壳单元中。用手轻轻拧紧外壳。通常情况下，切勿过度拧紧，否则装置在开始抽滤时会发生泄漏。
   2. 将原装瓶盖替换为已灭菌的瓶盖及连接的导管，小心地将内部导管插入试剂瓶中，避免接触导管。如有必要，使用镊子引导导管进入试剂瓶。
   3. 将外部导管穿过蠕动泵。
   4. 将预过滤器外壳单元连接至两根外部导管的末端（即每个试剂瓶配两个单元）。使用钳子拧紧连接处。
2. 海水过滤
   1. 开始过滤海水时，打开泵并将流速设置为 1。观察水流方向，确保水按正确方向被泵送。
   2. 让 500 ml 水自由流经预过滤器单元，流入 1 L 烧杯中。
   3. 关闭泵，将一个 Sterivex 滤器连接至预过滤装置自由端的雄性鲁尔接头处。用手牢固地拧紧预过滤器外壳。
   4. 观察预过滤器外壳以及外壳与通向试剂瓶的导管连接处是否有泄漏。若发生泄漏，关闭泵，松开并重新拧紧预过滤器外壳，再重新开启泵。
   5. 用 4 L 的烧瓶收集滤液。当烧瓶装满后，将滤液倒入洁净的试剂瓶中。务必记录每张滤膜所通过的液体体积。收集的滤液可进一步处理，例如用于病毒的过滤。
   6. 继续过滤，直至试剂瓶中无剩余水。通常每 20 L 试剂瓶的过滤时间在 4–5 小时之间；但该时间显著取决于水中生物量的多少。
   7. 过滤完成后，关闭泵并断开 Sterivex 滤器。
3. 滤器的保存
   1. 保存滤器时，首先使用 30–60 ml 注射器排出滤器中残留的水分。
   2. 使用移液器向滤器中加入 1.8 ml 裂解缓冲液，保留约 200 µl 空间，以便后续添加试剂。
   3. 用一小块 Parafilm 封住 Sterivex 滤器的顶部和底部，并在滤器上标记日期和样品编号。
   4. 将滤器放入预先贴好标签的 50 ml Falcon 管中，于 -80°C 保存。
   5. 从外壳单元中取出滤器，放入含有 2 ml 裂解缓冲液的已标记 50 ml Falcon 管中。于 -80°C 保存。
4. 清理工作
   1. 最后清理时，将曾插入试剂瓶内的导管放入盛有 0.1 M HCl 的烧瓶中。
   2. 将通向 4 L 烧瓶的导管重新导向原始试剂瓶中。
   3. 打开泵并以 3 的速度运行，将冲洗液收集至原始试剂瓶中。
   4. 最后，用已灭菌的水冲洗导管。

代表性结果：最终结果为两个Sterivix滤膜，每个滤膜含有来自约10升海水的微生物生物量，其粒径范围分别为 0.22 µm和2.7 µm。样品保存在裂解缓冲液中，可直接用于DNA提取。此外，该方法还会在GF/D预滤膜上收集并浓缩大于2.7 µm的生物量，同样保存在裂解缓冲液中，可用于DNA提取。若进行额外处理步骤，可进一步浓缩0.22 µm的滤过液，以收集病毒组分。

讨论

使用后必须用湿毛巾擦拭工作台和泵，以清除残留的盐水痕迹，否则会腐蚀设备。尽管该操作步骤简单，但所需时间可能较长，具体取决于待过滤样品中生物量或碎屑的浓度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蠕动泵		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL 软管		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	用于过滤装置
软管夹		Cole-Parmer	0683204	用于过滤装置
1/4” x 3/16” 管道接头		Cole-Parmer	31702-20	用于过滤装置
聚丙烯预滤器外壳		ADVANTEC	501200	用于过滤装置
金属鲁尔接头（软管端转雄性鲁尔锁）		Cole-Parmer	31507-27	用于过滤装置
2“ 磁铁			用于过滤装置
三通瓶盖				用于过滤装置
GV 0.22 μm STERIVIX 滤器		EMD Millipore	SVGV01R5
直径 47 mm、孔径 2.7 μm 的 GF/D 滤膜		Whatman, GE Healthcare	1823047
裂解缓冲液	试剂			0.75 M 蔗糖，40 mM EDTA，50 mM Tris（pH 8.3）
0.1 % HCl	试剂			用于过滤后冲洗
高压灭菌水	试剂			用于过滤后冲洗