小体积（1–3 L）近海海水样品过滤法

摘要

本视频记录了从水体中对微生物生物量进行小体积（约1 L）过滤的过程。

摘要

工作流程始于采集近海海水样品，用于后续的微生物群落、营养盐和痕量气体分析。本次演示的样品采自位于萨尼奇湾（Saanich Inlet）运行的 HMS John Strickland 船只甲板上。本视频记录了从水体中过滤获取小体积（约 1 L）微生物生物量的过程。该方案是此前所述大体积采样方案的延伸，主要区别在于：此处省略了预过滤步骤，因此所有尺寸类别的生物量均被收集，直至 0.22 μm 滤膜的截留极限。此类样品特别适用于核酸分析。装置准备、过滤和清洁步骤各需约 20 至 30 分钟。若同时使用两台蠕动泵，可同时处理多达 8 个样品。为防止采样间隔期间形成生物膜，所有过滤设备在使用后必须立即用稀盐酸和去离子水冲洗，并进行高压灭菌处理。

方案

1. 过滤装置的设置
   1. 过滤前，先擦去满瓶外表面的冷凝水，并称重。
   2. 将一个灭菌桶放在泵的一侧，废液瓶放在另一侧。
   3. 然后将一个装满样品的瓶子放入灭菌桶中；但此时不要打开瓶盖。
   4. 将管路穿过蠕动泵，使管路的鲁尔端插入废液瓶中。
   5. 使用镊子取下无菌25 ml移液管中的棉塞，并将该移液管连接到管路的另一端。
2. 海水过滤
   1. 开始过滤海水时，打开瓶盖并插入移液管。启动泵并将流速设为1。观察确保水流方向正确。
   2. 让约100 ml水通过整个管路系统。
   3. 关闭泵，并将Sterivex滤器连接到管路自由端的雄性鲁尔接头上。
   4. 继续过滤，直至瓶中无剩余海水。
3. 滤器的保存
   1. 为保存滤器，首先用30–60 ml注射器排出残留的水分。
   2. 用Parafilm封住Sterivex滤器底部。使用移液管向滤器中加入1.8 ml裂解缓冲液，保留约200 µl空间，以便后续加入试剂。
   3. 然后用一小块Parafilm密封Sterivex滤器顶部，并用日期和样品编号标记滤器。
   4. 将滤器置于预先标记好的50 ml离心管中，于-80°C保存。
4. 清理工作
   1. 将25 ml移液管插入含有0.1% HCl的烧瓶中，开启泵。
   2. HCl清洗后，用灭菌水冲洗管路。
      
      最后，称量已空的1 L瓶子的质量，以计算通过滤器的水体积。

代表性结果：每1升水样可获得一个Sterivix滤膜，其中含有大于0.22 µm的生物量。该滤膜保存在裂解缓冲液中，用于后续的DNA提取与分析。最终结果为每1升水样对应一个保存在裂解缓冲液中的Sterivix滤膜，可直接用于DNA提取。滤膜中含有大于0.22 µm的生物量。在进行环境DNA（eDNA）提取前，滤膜可保存于-80°C。

讨论

使用后必须用湿毛巾擦拭工作台和泵，以清除残留的盐水痕迹，否则会腐蚀设备。尽管该操作步骤简单，但所需时间可能较长，具体取决于待过滤样品中生物量或碎屑的浓度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蠕动泵	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL 软管	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	用于过滤装置
软管夹	Cole-Parmer	0683204	用于过滤装置
1/4” x 3/16” 管道接头	Cole-Parmer	31702-20	用于过滤装置
聚丙烯预滤器外壳	ADVANTEC	501200	用于过滤装置
金属鲁尔接头（软管端转雄性鲁尔锁）	Cole-Parmer	31507-27	用于过滤装置
2“ 磁铁			用于过滤装置
三口瓶盖			用于过滤装置
GV 0.22 μm STERIVIX 滤器	EMD Millipore	SVGV01R5
直径 47 mm、孔径 2.7 μm 的 GF/D 滤膜	Whatman, GE Healthcare	1823047
裂解缓冲液			0.75 M 蔗糖，40 mM EDTA，50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			用于过滤后冲洗
高压灭菌水			用于过滤后冲洗