本实验展示了从全外周血中纯化并体外扩增抗原特异性CD4+ T细胞，以及利用MHC II类四聚体对其进行可视化检测的方法。四聚体技术能够直接可视化具有单一抗原特性和明确MHC II类限制性的T细胞。
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摘要
摘要
主要组织相容性复合体（MHC）II类四聚体可实现通过流式细胞术直接可视化抗原特异性的CD4+ T细胞。该方法依赖于肽段负载的MHC分子与其相应T细胞受体之间的高度特异性相互作用。尽管单个MHC/肽段分子的亲和力较低，但通过链霉亲和素交联MHC/肽段复合物可增强相互作用的亲合力，从而使其可用作染色试剂。由于CD4+ T细胞的频率相对较低（单个特异性约1/300,000），该检测方法采用体外扩增步骤以提高其检测阈值。单个核细胞通过Ficoll密度梯度离心法从外周血中纯化获得，随后利用生物素标记的抗体混合物及抗生物素包被的磁珠通过阴性选择法分离CD4+细胞。将CD4-细胞组分中的贴壁细胞作为抗原呈递细胞，通过在培养基中加入抗原肽和IL-2对CD4+ T细胞进行扩增。扩增后的细胞与相应的II类四聚体在37°C孵育1小时进行染色，随后使用表面抗体（如抗-CD4、抗-CD3和抗-CD25）进行二次染色。标记完成后，细胞可直接进行流式细胞术分析。四聚体阳性细胞通常在扩增后的CD4+细胞中形成一个明显独立的细胞群，且通常为CD25+，常表现为CD4高表达。由于背景四聚体染色水平可能有所差异，阳性染色结果应始终与同一细胞使用无关四聚体的染色结果进行比较。该基本检测方法存在多种变体。四聚体阳性细胞可被分选用于进一步的表型分析，或用于ELISPOT、增殖实验等其他下游功能检测。已有多个研究团队成功实现了四聚体与抗细胞因子抗体或抗-FoxP3抗体的共染色。
方案
1. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离
- 采集血样——应使用注射器或采血管收集血液，并以肝素（1:50 比例）抗凝，防止血液凝固。预计每毫升血液可获得约 1×106 个外周血单个核细胞（PBMC），其中约 40% 为 CD4 阳性（CD4+）T 细胞。
- 将血液分装至 50 mL 圆锥形离心管中，每管 25 mL。若血液已发生分层，分装前应轻柔混匀，以均匀分布血浆。
- 加入 PBS，使总体积达到 40 mL，然后通过吸取 11 mL Ficoll，插入血样管中，小心将移液器辅助装置从移液管上取下，使 Ficoll 缓慢流入管底。待液面平衡后，缓慢将移液管从血样管中取出并弃去。
- 盖紧血样管，放入 Aerosolve 离心罐中。牢固封闭离心罐，以 900×g 离心 20 分钟——不使用刹车。此步骤结束时严禁使用刹车，因为制动力会扰动细胞分层。
- 离心后，PBMC 应在上层黄色血浆与下层透明 Ficoll 之间形成明显的白色层。使用转移移液管轻柔吸取白细胞层，并转移至新管中。PBMC 中可能混入少量血浆和 Ficoll，但应避免吸取红细胞层。通常在此步骤可将两管血液样本合并至同一细胞管中，以增大沉淀体积。
- 加入 PBS，使总体积达到 50 mL，以 500×g 离心 15 分钟——在 Aerosolve 离心罐中使用低刹车。
- 使用巴斯德移液管吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
- 加入 5–6 mL 溶血缓冲液处理各管，轻柔混匀以去除团块，孵育时间不超过 5 分钟。
- 加入 PBS，使总体积达到 50 mL，以 230×g 离心 10 分钟——使用低刹车。此后较低速度的离心不再需要 Aerosolve 离心罐。
- 洗涤两次：使用巴斯德移液管吸除上清液，用 PBS 重新充满离心管，以 230×g 离心 10 分钟。
- 在最后一次洗涤步骤前，取一部分重悬的细胞，用台盼蓝稀释后，使用血细胞计数板进行计数。该细胞计数将决定后续 T 细胞分离步骤中所用试剂的体积。
2. CD4+ T 细胞分离*
- 吸去液体，加入洗脱缓冲液，使每1000万细胞的总体积达到40 µL。通常需要加入30 µL缓冲液以及残留的沉淀体积。
- 将此体积转移至15 mL锥形管中。
- 加入CD4分离试剂盒中的抗体混合物——每1000万细胞加入10 µL，盖紧管盖，并置于冰上孵育10分钟。
- 从冰上取出管子，打开管盖，每1000万细胞加入30 µL洗脱缓冲液。
- 加入CD4分离试剂盒中的磁珠——每1000万细胞加入20 µL，盖紧管盖，并置于冰上孵育15分钟。
- 加入10倍体积的洗脱缓冲液进行洗涤，并在230×g下离心10分钟。
- 在离心过程中，在工作区设置好磁力架和5 mL聚丙烯管。
- 吸去细胞沉淀中的液体，加入2 mL洗脱缓冲液，使用移液器去除团块。
- 使用同一移液器将细胞转移至5 mL管中，并放入磁力架中孵育15分钟。
- 小心地将CD4+细胞组分倒入已标记的15 mL管中：翻转磁力架，倒出液体，仅保留最后一滴。
- 向5 mL管中再加入2 mL洗脱缓冲液，然后从磁力架上取下。
- 轻轻冲洗管壁上的CD4-细胞，并将其转移至另一个已标记的15 mL管中。
- 向每根管中加入2 mL T细胞培养基，取出部分细胞用于计数，并在230×g下离心10分钟。
- 用台盼蓝稀释细胞样品，使用血细胞计数板进行计数。这些细胞计数结果将决定扩增培养步骤所需的孔数。
* 或者，可根据生产商说明书，使用 MACS 柱和磁珠（Miltenyi Biotec）、AutoMACS 细胞分选仪（Miltenyi Biotec）或 Robosep 细胞分选仪（Stem Cell Technologies）替代步骤 2.2 – 2.11。
3. 体外扩增培养
- 吸弃 CD4+ 和 CD4- 细胞沉淀中的液体，并根据细胞计数结果加入培养基（通常每毫升含 300 万 CD4+ 细胞和 1000 万 CD4- 细胞的浓度适合建立培养体系）。扩增培养需在 48 孔板的每个孔中加入 300–500 万个 CD4- 细胞和 200–300 万个 CD4+ 细胞，总体积为 1 mL 培养基。通常情况下，CD4+ 细胞是限制性细胞群。
- 如需要，对 CD4- 细胞进行照射处理（5000 Rads）。将 CD4- 细胞分装至 48 孔板的相应孔中，每孔加入 300–500 μL。将培养板置于 37°C 培养箱中孵育 1 小时。贴壁的 CD4- 细胞将在扩增培养中作为抗原呈递细胞。
- 从培养箱中取出培养板。
- 通过移液管向每孔加入 500 μL 新鲜培养基，并使用移液管轻柔吹打 12–20 次，随后完全吸弃液体，完成洗涤步骤。此洗涤过程将在孔底留下一层贴壁的抗原呈递细胞。
- 洗涤完成后，向每孔加入适量培养基以润湿孔底（约 100 μL），避免贴壁细胞干燥。
- 向每孔加入 200–300 万个 CD4+ 细胞。如有必要，补充额外培养基使每孔总体积达到 1 mL。
- 向每孔加入所需肽段。刺激的典型终浓度为 10 μg/mL。
- 将培养板置于 37°C 培养箱中培养 7 天。
- 7 天后，向每孔加入 50 μL Hemogen IL-2（或等效物，如重组 IL-2，终浓度为 10 IU/mL）。
- 在随后的每一天，使用显微镜监测细胞生长情况。对于尚未达到汇合的孔，移除一半培养基，加入新鲜培养基和 50 μL IL-2 进行换液；对于已汇合的孔，将细胞重悬，取一半细胞转移至新孔，加入新鲜培养基和 50 μL IL-2。将细胞放回培养箱继续培养。
- 培养 13–15 天后，扩增的细胞即可用于四聚体检测。
4. 通过四聚体染色法可视化T细胞
- 购买或制备与刺激后的 CD4+ T 细胞相匹配的肽/MHC 四聚体（参见讨论部分关于四聚体试剂来源的信息）。四聚体应为浓度约 0.5 mg/mL 的溶液。
- 从培养箱中取出培养板
- 小心吸去每个孔中一半的培养基
- 将每个孔中的部分细胞转移至 5 mL 聚苯乙烯 FACS 管中，通常为 75 μL 或约 50,000 个细胞
- 加入四聚体，通常每 50 μL 总体积加入 1 μL，并将样本置于 37°C 培养箱中孵育 1–2 小时。建议同时使用错配的四聚体对每个孔的另一份细胞样本进行染色，作为阴性对照。
- 通过加入每种抗体 3–10 μL 对细胞进行 CD3、CD4 和 CD25 抗体标记。也可使用其他或替代的抗体标记物。但请勿使用 PE 标记的抗体，因为该通道需保留用于四聚体检测。此时，可使用额外细胞制备单色或同型对照样本。
- 将标记抗体的细胞在冰上或 4°C 条件下孵育 15–30 分钟。
- 每管加入 0.5 至 2 mL 流式缓冲液洗涤，并在 230×g 离心 10 分钟。
- 小心倾去 FACS 管中的上清液。将所有管置于带盖容器中（最好在冰上）保存，用于后续流式细胞分析。
5. 流式细胞仪数据采集与分析
- 使用校准微球校准流式细胞仪。
- 验证仪器设置：
- 使用未染色的对照细胞或同型对照，调整活淋巴细胞门的位置（FSC 对 SSC）。通过调节增益设置，将各通道的自发荧光群体中心调整至每个坐标轴第一对数区以下，以去除所有通道的自发荧光干扰。
- 使用单色对照管，通过调节补偿设置，将各单色信号的事件中心调整至正确的象限内。
- 使用一条用无关四聚体染色的样本管对仪器设置进行精细调整。特别是PE通道的设置可能需要调整，因为四聚体染色通常比抗体对照更亮。无关四聚体染色的CD4+细胞比例应小于<0.5%。
- 采集每管数据
- 采集每个样本管和阴性对照管的事件数据
- 采集并保存至少20,000个事件用于分析
- 分析数据
- 将数据文件导入流式细胞分析软件（例如 CellQuest 软件、WinMDI 或 FlowJo）。首先使用无关四聚体染色的样本管开始分析。
- 绘制FSC与SSC散点图，并在活淋巴细胞群周围绘制门控（图1，左上图）。
- 绘制CD4与CD3散点图（门控限定为活淋巴细胞），并在CD3+和CD4+细胞群周围绘制门控（图1，右上图）。
- 绘制CD4与四聚体散点图（门控限定为CD3+淋巴细胞），并设置象限边界，使CD4+四聚体+细胞群比例小于0.5%（图1，左下图）。
- 绘制CD25与四聚体散点图（门控限定为CD4+淋巴细胞），并设置象限边界，使CD25+四聚体+细胞群比例小于0.5%（图1，右下图）。
- 在不更改门控设置的前提下，分析所有样本管的数据。
图1. 代表性阴性对照四聚体染色结果。左上图显示前向散射与侧向散射，以及淋巴细胞大小门控（R1）。右上图基于R1门控，显示抗-CD4与抗-CD3染色结果，以及CD3+（R2）和CD4+（R3）门控区域。左下图基于R2门控，显示抗-CD4与四聚体染色结果。右下图基于R3门控，显示抗-CD25与四聚体染色结果。两个四聚体图的象限均设定为0.5%。
6. 典型结果
- 四聚体阳性细胞应在扩增的 CD4+ 细胞中形成一个明显独立的细胞群（图 2）。
- 四聚体阳性细胞通常为 CD25+，且常表现为 CD4 高表达。
- 在某些情况下，MHC/肽段组合可能产生背景染色（通常由溶解度较差的肽段引起）。此类背景染色可通过 CD4 与四聚体或 CD25 与四聚体的散点图与真实阳性信号区分开来，因为“假阳性”细胞在这些图中不会形成单一且明显的细胞群（图 3）。
图2. 典型的四聚体阳性染色结果。图中布局和设门策略与图1相同。四聚体阳性细胞在抗CD4抗体对四聚体图中表现为明显的CD4高表达群体，在抗CD25抗体对四聚体图中表现为明显的CD25+群体。
图3. 典型的“假阳性”四聚体染色结果。该图的面板布局和设门策略与图1相同。抗-CD4与四聚体图显示弥散的“隆起状”染色。抗-CD25与四聚体图也显示“隆起状”染色，且无明显趋向于CD25阳性。
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讨论
了解 CD4+ T 细胞在免疫中的作用具有根本性的重要意义。然而，使用传统方法检测和分离抗原特异性的 CD4+ T 细胞可能较为困难。相比之下，MHC II 类四聚体（tetramer）能够直接可视化具有目标抗原特异性的 CD4+ T 细胞。本视频展示了 CD4+ T 细胞的分离、纯化和体外扩增，以及随后使用四聚体进行检测的流程。II 类四聚体是由可溶性生物素化的 II 类 α/β 二聚体围绕荧光标记的链霉亲和素核心结合而成的荧光蛋白偶联物（图 4）。本视频中使用的四聚体由贝纳罗亚研究所（Benaroya Research Institute）的四聚体核心实验室利用昆虫细胞培养系统制备（1）。这些四聚体以 0.5 mg/mL 的溶液形式保存，可在 4°C 下储存 6 至 18 个月。四聚体切勿冷冻，因为冻融过程可能使藻红蛋白（PE）标记从链霉亲和素核心上脱落。II 类染色试剂可从多个来源获得（表 1），并被命名为四聚体（tetramers）、“ultimers” 和多聚体（multimers）。需要注意的是，此处描述的四聚体检测方法与 I 类四聚体的检测流程不同。I 类四聚体染色通常在 4°C 下效果最佳，而 II 类四聚体染色通常需要...
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致谢
感谢 Dick Foley 和 Leigh Kimball 在拍摄和视频制作中的关键贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| II级层流生物安全柜 | 设备 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | 或同类产品 |
| 50 mL 圆锥形离心管 | 设备 | VWR international | 47747-182 | 或同类产品 |
| 1× PBS（无Ca/Mg） | 试剂 | Hyclone | SH30028.02 | 或同类产品 |
| Ficoll-paque PLUS | 试剂 | GE Healthcare | 17-1440-03 | 需用铝箔包裹避光 |
| Pipet Aid XP | 设备 | Drummond Scientific | 4-000-101 | 或同类产品 |
| 10 mL 移液管 | 设备 | Corning | CLS4492 | 或同类产品 |
| Aerosolve 样品管 | 设备 | Beckman Coulter Inc. | 359481 | 配50 mL 插件 |
| 离心机 | 设备 | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | 或同类产品 |
| 移液器吸头 | 设备 | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | 或同类产品 |
| 巴斯德移液管 | 设备 | VWR international | 14672-200 | 或同类产品 |
| 溶血缓冲液 | 试剂 | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl，1.0 g/L NaHCO3，0.04 g/L 乙二胺四乙酸二钠 |
| 台盼蓝 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T6146 | PBS中0.2% |
| 血细胞计数板 | 设备 | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | 设备 | VWR international | 05-527-90 | 或同类产品 |
| 运行缓冲液 | 试剂 | N/A | N/A | PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA |
| MACS CD4+ T细胞分离试剂盒II | 试剂 | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | 或同类产品 |
| EasySep® 磁铁 | 设备 | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL 聚丙烯管 | 设备 | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | 试剂 | Invitrogen | 22400-089 | 含25 mM HEPES |
| 混合人血清 | 试剂 | N/A | N/A | 来自健康供体，经热灭活并过滤 |
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | 试剂 | Invitrogen | 1570-063 | 或同类产品 |
| 500 mL 0.22 微米瓶顶过滤器 | 设备 | Nalge Nunc international | 595-3320 | 或同类产品 |
| 48孔板 | 设备 | Costar | 3548 | 或同类产品 |
| 37°C CO2 培养箱 | 设备 | Sanyo | MCO-18AIC | 或同类产品 |
| 20 mg/mL 合成多肽 | 试剂 | N/A | N/A | 由任意多肽供应商定制合成 |
| 5 mL FACS 管 | 设备 | Falcon BD | 352008 | 聚苯乙烯材质 |
| 多肽负载的II类四聚体（如所述） | 试剂 | N/A | N/A | 由BRI四聚体核心制备 |
| 抗CD3抗体 | 试剂 | BD Biosciences | 347344 | 或同类产品 |
| 抗CD4抗体 | 试剂 | eBioscience | 17-0049-73 | 或同类产品 |
| 抗CD25抗体 | 试剂 | eBioscience | 11-0259-73 | 或同类产品 |
| Facs Calibur 流式细胞仪 | 设备 | BD Biosciences | 342975 | 或同类产品 |
参考文献
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
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