痘苗病毒感染及病毒基因表达的时间分析：第二部分

摘要

HeLa细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第2部分（共3部分）。

摘要

该家族Poxviridae由大型双链DNA构成的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科成员包括orthopox属包括天花病毒（variola），即人类天花的病原体，猴痘病毒（monkeypox）以及痘苗病毒（vaccinia, VAC），后者是痘病毒科的典型代表。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但它们在病毒生命周期中各自发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主和病毒基因表达的调控机制，我们采用了全基因组方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了痘苗病毒感染HeLa细胞的时间过程实验，并在感染后多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。

方案

第一部分：从RNA合成cDNA

1. 使用 Ambion Amino Allyl MessageAmp II 试剂盒之前，向洗涤缓冲液中加入推荐体积的100%乙醇。
2. 在PCR反应管中，加入100 ng至5 µg总RNA和1 µl T7寡聚(dT)引物，用无核酸酶水将体积调至12 µl。
3. 在70°C下孵育样本10分钟，使用PCR仪。
4. 从70°C环境中取出RNA样品，短暂离心，置于冰上。
5. 制备 1^st 链合成预混液，室温保存（预留10%过量以补偿移液误差）。 （表1）
6. 轻轻吹打混匀主混合液或轻轻振荡混匀，然后短暂离心。
7. 将8µl的混合液转移至每个RNA样本中，用移液器轻轻吹打3-4次以混匀。
8. 在42°C下孵育2小时，使用PCR仪。
9. 短暂离心样品并置于冰上，立即进行双链DNA合成的下一步操作。
10. 制备 2^nd 链合成预混液置于冰上（额外增加10%以补偿移液误差）。 （表2）
11. 轻轻吹打混匀主混合液或振荡混匀，然后短暂离心。
12. 将80 µl转移至每个样品中，然后通过上下吹打3-4次轻轻混匀。
13. 在PCR仪中于16°C孵育2小时。
14. 孵育2小时后，立即进行cDNA纯化步骤，或在–20°C下速冻保....

讨论

关键步骤

不建议进行第二轮扩增，因为已在芯片数据中观察到偏差。在每个酶促步骤中均需仔细混匀（1^st 和 2^nd cDNA合成和体外转录（IVT）是获得良好扩增产量的关键步骤，每个酶促反应步骤均需在适宜温度下孵育。建议使用带有可调节加热盖的PCR仪——即使在空气杂交炉或水浴杂交中，IVT过程中的温度偏差小至2–3摄氏度，也可能显著影响扩增产物的得率。

应用/意义

本方案产生的标记RNA可用于与人源、病毒或定制的微阵列杂交，以评估培养细胞在感染后的基因表达应答。微阵列平台各不相同，因此请遵循制造商的说明，由标记探针制备杂交混合液。

利用定制设计的痘病毒芯片¹，我们能够根据杂交信号出现的时间以及转录本检测是否依赖病毒DNA复制，将基因分类为“早期”或“晚期”等大类。我们观察到每个时间类别中基因的预期功能类别（即预期的早期、中期和晚期基因），但在转录的确切时间.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amino Allyl MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒	试剂	Applied Biosystems	AM1753	适用于 20 次反应
Amino Allyl MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒	试剂	Applied Biosystems	AM1821	适用于 100 次反应，96 孔板格式
NanoDrop ND-1000 UV-VIS 分光光度计	其他	NanoDrop	ND-1000	或性能相当的分光光度计