HeLa细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第2部分（共3部分）。
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摘要
摘要
该家族Poxviridae由大型双链DNA构成的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科成员包括orthopox属包括天花病毒（variola），即人类天花的病原体，猴痘病毒（monkeypox）以及痘苗病毒（vaccinia, VAC），后者是痘病毒科的典型代表。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但它们在病毒生命周期中各自发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主和病毒基因表达的调控机制，我们采用了全基因组方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了痘苗病毒感染HeLa细胞的时间过程实验，并在感染后多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。
方案
第一部分：从RNA合成cDNA
- 使用 Ambion Amino Allyl MessageAmp II 试剂盒之前，向洗涤缓冲液中加入推荐体积的100%乙醇。
- 在PCR反应管中，加入100 ng至5 µg总RNA和1 µl T7寡聚(dT)引物，用无核酸酶水将体积调至12 µl。
- 在70°C下孵育样本10分钟，使用PCR仪。
- 从70°C环境中取出RNA样品，短暂离心，置于冰上。
- 制备 1st 链合成预混液，室温保存（预留10%过量以补偿移液误差）。 （表1）
- 轻轻吹打混匀主混合液或轻轻振荡混匀，然后短暂离心。
- 将8µl的混合液转移至每个RNA样本中，用移液器轻轻吹打3-4次以混匀。
- 在42°C下孵育2小时，使用PCR仪。
- 短暂离心样品并置于冰上，立即进行双链DNA合成的下一步操作。
- 制备 2nd 链合成预混液置于冰上（额外增加10%以补偿移液误差）。 （表2）
- 轻轻吹打混匀主混合液或振荡混匀，然后短暂离心。
- 将80 µl转移至每个样品中，然后通过上下吹打3-4次轻轻混匀。
- 在PCR仪中于16°C孵育2小时。
- 孵育2小时后，立即进行cDNA纯化步骤，或在–20°C下速冻保存。
第二部分：双链 cDNA 纯化
- 从冰箱中取出cDNA纯化试剂，使用前于室温下平衡30分钟。使用前轻轻振荡瓶体，充分重悬磁性cDNA结合珠。
- 将无核酸酶水等分至1.5 mL离心管中，在前一步2小时孵育期间，于50–60°C孵育至少10分钟。
- 向每个样品中加入 180 µl cDNA Pure，通过反复移液充分混匀。将样品转移至 96 孔圆底板中。
- 继续在轨道摇床上轻轻振荡混匀样品，至少持续2分钟。
- 将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。将培养板留在磁力架上约6分钟，或直至混合液变得透明且结合用磁珠完全沉降。
- 使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，使用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。
- 从磁力架上取下培养板。
- 向每个孔中加入 150 µl cDNA 洗涤缓冲液，并在摇床上以中等速度振荡 1 分钟。由于洗涤缓冲液的表面张力较低，此步骤中磁珠不会分散。
- 将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。
- 使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。
- 从磁力架上取下培养板。
- 重复洗涤2次nd 用150µl cDNA洗涤缓冲液洗涤。
- 2分钟后nd 洗涤后，在旋涡振荡器上以最大速度振荡平板2分钟，使磁珠干燥。切勿过度干燥！
- 向每个样本中加入18 µl预热的无核酸酶水，从磁珠中洗脱cDNA。
- 在轨道摇床上剧烈振荡平板3分钟，然后检查磁珠是否完全分散。若未完全分散，则继续振荡。
- 磁珠完全分散后，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。
- 小心地将洗脱的 cDNA（约 16 µl）转移至新的 PCR 板（或 PCR 管）中。
- 直接进入下一步，或将 cDNA 在 -20°C 冻存。
第3部分：体外转录（IVT）
- 在室温下配制体外转录（IVT）主混合液。（表3）
- 轻轻吹打主混合液或轻弹管壁以混匀，并短暂离心。
- 向每个样品中加入24 µl，通过上下吹打3–4次轻轻混匀。
- 在热循环仪中37°C孵育14小时，随后保持在4°C，直至进行下一步操作。
第4部分：体外转录后aRNA的纯化
- 使用前将RNA结合磁珠短暂涡旋，以获得均匀的混合物。
- 在室温下配制 aRNA 结合混合液。 （表4） 这可以提前完成——制备好的结合混合液可在室温下保存长达一周。
- 充分涡旋混匀。
- 将aRNA洗脱缓冲液分装至1.5 mL离心管中，在50–60°C孵育至少10分钟。
- 向每个样本中加入70µl aRNA结合混合液，通过上下吹打3-4次充分混匀。
- 将样品从PCR板转移至96孔圆底板中。
- 向每个样品中加入50 µl 100%异丙醇，用移液器上下吹打3–4次以充分混匀。
- 在摇床上轻轻振荡平板，至少 2 分钟，以充分混匀样品。
- 将培养板置于磁力架上以捕获磁珠。保持培养板在磁力架上，直至混合物变得透明且结合磁珠完全沉降。
- 使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。
- 从磁力架上取下培养板。
- 向每个孔中加入100 µl aRNA洗涤液，在摇床上以中等速度振荡1分钟。此步骤中磁珠可能未完全分散。
- 将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。
- 使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。
- 从磁力架上取下培养板。
- 重复洗涤一次nd 用100 µl aRNA洗涤液洗涤。
- 2之后nd 洗涤后，在最大转速下将平板置于摇床上震荡1分钟以干燥珠子。切勿过度干燥样品！
- 向每个样本中加入40 µl预热的aRNA洗脱缓冲液，从磁珠中洗脱aRNA。
- 在轨道摇床上剧烈振荡平板3分钟，然后检查磁珠是否已充分分散。若未充分分散，则继续振荡。
- 磁珠完全分散后，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。上清液中含有纯化后的氨基烯丙基标记的aRNA。
- 将洗脱的aRNA小心转移至新的PCR板（或PCR管）中。
- （可选步骤）使用NanoDrop分光光度计测量1.5 µl样品以检测RNA浓度。
- 立即进入下一步操作，或将aRNA在–80°C保存。
表1：cDNA 1st 链合成预混液
| 试剂 | 单次反应所需用量 |
| 10X First Strand Buffer | 2 µl |
| dNTP Mix | 4 µl |
| Ribonuclease Inhibitor | 1 µl |
| Array Script | 1 µl |
表 2：cDNA 2nd 链合成预混液
| 试剂 | 单次反应所需用量 |
| 无核酸酶水 | 63 µl |
| 10X 第二链缓冲液 | 10 µl |
| dNTP 混合液 | 4 µl |
| DNA 聚合酶 | 2 µl |
| RNase H | 1 µl |
表3：体外转录主混合液
| 试剂 | 单次反应所需用量 |
| aaUTP 溶液 (75 mM) | 2 µl |
| ATP、CTP、GTP 混合液 (25 mM) | 12 µl |
| T7 UTP 溶液 (75 mM) | 2 µl |
| T7 10X 反应缓冲液 | 4 µl |
| T7 酶混合液 | 4 µl |
表4：aRNA结合反应体系
| 试剂 | 单次反应所需用量 |
| RNA 结合磁珠* | 10 µl |
| 磁珠重悬液* | 4 µl |
| 100% 异丙醇** | 6 µl |
| aRNA 结合缓冲液浓缩液 | 50 µl |
* 先将RNA结合磁珠与磁珠重悬液混合。
** 加入异丙醇并充分混匀，然后再加入aRNA结合缓冲液浓缩液。
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讨论
关键步骤
不建议进行第二轮扩增，因为已在芯片数据中观察到偏差。在每个酶促步骤中均需仔细混匀（1st 和 2nd cDNA合成和体外转录（IVT）是获得良好扩增产量的关键步骤，每个酶促反应步骤均需在适宜温度下孵育。建议使用带有可调节加热盖的PCR仪——即使在空气杂交炉或水浴杂交中，IVT过程中的温度偏差小至2–3摄氏度，也可能显著影响扩增产物的得率。
应用/意义
本方案产生的标记RNA可用于与人源、病毒或定制的微阵列杂交，以评估培养细胞在感染后的基因表达应答。微阵列平台各不相同，因此请遵循制造商的说明，由标记探针制备杂交混合液。
利用定制设计的痘病毒芯片1，我们能够根据杂交信号出现的时间以及转录本检测是否依赖病毒DNA复制，将基因分类为“早期”或“晚期”等大类。我们观察到每个时间类别中基因的预期功能类别（即预期的早期、中期和晚期基因），但在转录的确切时间...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
怀特黑德研究所研究员基金
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒 | 试剂 | Applied Biosystems | AM1753 | 适用于 20 次反应 |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒 | 试剂 | Applied Biosystems | AM1821 | 适用于 100 次反应，96 孔板格式 |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS 分光光度计 | 其他 | NanoDrop | ND-1000 | 或性能相当的分光光度计 |
参考文献
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
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- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
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