使用FM染料标记法测量神经元中的胞吐作用

摘要

测量囊泡释放动力学的能力有助于深入了解神经传递的一些基本机制。在此，我们利用红色荧光染料FM 4-64标记囊泡，并通过实时成像技术来测定海马神经元培养物中突触前囊泡的释放速率。

摘要

测量囊泡释放动力学的能力有助于深入了解神经传递的一些基本机制。本实验中，我们采用FM染料标记囊泡的实时成像技术，监测突触前囊泡释放速率。FM4-64是一种红色荧光亲脂性苯乙烯类染料，在胞吞作用被激活时可嵌入突触囊泡膜中。由于与脂质的相互作用，该染料在结合囊泡时荧光显著增强，发出明亮信号，而在细胞外液中则仅有微弱荧光。在通过洗涤步骤去除质膜外多余染料后，残留的FM染料主要集中于囊泡内部；当再次施加电刺激诱导胞吐作用时，染料随囊泡内容物一同释放。囊泡释放速率通过荧光信号的下降速率进行测定。由于FM染料可在体外短暂施加，因此是测定神经元培养物中胞吐速率的有效工具，尤其适用于比较转染突触与邻近对照突触小结之间的释放速率。 关键词：囊泡释放动力学，神经传递，FM染料成像，FM4-64，胞吞作用，胞吐作用，突触前囊泡，荧光信号，神经元培养，电刺激

方案

细胞：大鼠（或小鼠）原代海马神经元培养物（体外培养14-28天）。

刺激：通过两个铂电极进行电刺激；70-90 mV

显微镜技术：倒置CCD荧光显微镜配备60倍油镜。

软件：Slidebook（Intelligent Imaging Innovations，美国加利福尼亚州圣莫尼卡）

详见补充方法页面

1. 将 HEPES 缓冲盐水（HBS）升温至室温。  加入谷氨酸受体拮抗剂 APV（终浓度 50 µM）和 CNQX（终浓度 10 µM）。  每次 FM 实验通常需要 20–30 mL HBS。配制 10 µM FM 4-64（Molecular Probes）工作液时，将储备液用含拮抗剂的 HBS 稀释 1000 倍。  每次实验配制 2 mL FM 溶液。用铝箔覆盖溶液以避免光照。
   
   
2. 将含有神经元的盖玻片安装到电极腔室中。  检查腔室中的培养基液面是否与腔室顶部齐平，并完全覆盖电极。  清除盖玻片底部多余的液体。如使用油镜，则在物镜上添加镜油。
   
   
3. 设置灌流装置。  首先按以下顺序依次用几毫升液体冲洗（每种液体充分流过后再加入下一种）：水、乙醇、水，然后是 HBS。接着加入 HBS（保留几毫升用于后续手动添加），并关闭灌流系统。  将灌流出口和吸液管分别置于盖玻片两侧边缘。  灌流出口应伸入腔室内，而吸液管应置于最上方。  在加入 HBS（无论是通过灌流还是手动添加）时，打开吸液并调整其位置，使培养基液面保持在刚好完全覆盖电极的水平。
   
   
4. 在盖玻片上寻找希望成像的区域，并大致调焦。  理想区域应含有大量突触，但密度不宜过高，以免单个结构难以分辨。  区域内应无或仅有极少的细胞体、非特异性膜结构（如星形胶质细胞团块）或其他非特异性物质（如棉絮）。  FM 染料可能非特异性地吸附在这些物质上。
   
   
5. 使用“WG”滤光立方体（以绿光激发，收集红光至远红光发射信号）。  在 Slideview 中设置“采集偏好”，使图像 0 开始时给予 900 个动作电位（AP），频率为 10 Hz（通常此加载刺激使用 300 至 900 个动作电位）。在图像窗口中选择“fluo-vis-red”滤光设置，并将曝光时间调整为 100 ms。  关闭任何已存在的延时成像设置。在准备开始刺激前，不要进行任何图像采集。
   
   
6. 确保吸液已开启。迅速将 FM 溶液（2 mL）加至吸液端对侧的腔室中。  立即在图像窗口中点击“确定”以采集图像并开始刺激。刺激结束后等待 30–45 秒，然后快速加入约 2 mL HBS 洗去 FM 染料（我通常用手持移液器操作，但也可通过灌流完成）。
   
   
7. 通过灌流用 HBS 洗涤 FM 染料约 10 分钟。  灌流速率应为 1–1.5 mL/min。在此洗涤过程中，更改刺激设置，使刺激在图像 10 开始（通常此去染色刺激使用 900 至 1200 个动作电位，频率为 10 Hz）。约在洗涤进行至 7 分钟时，再次检查设置（确保刺激在图像 10 开始）。  现在使用小范围对焦窗口选择并聚焦一个子区域。确保在进入下一步前已更改刺激设置。采集单张图像以判断洗涤是否完全（单个突触应呈现清晰的点状结构）。  若未完全洗净，将流速额外提高 0.5 mL/min，并再等待 2 分钟。
   
   
8. 洗涤完成后，根据需要调整曝光时间，以获得良好且清晰的信号（通常为 50–100 ms）。由于 FM 染料光漂白迅速，应尽量缩短曝光时间。然后设置延时成像参数，每 5 秒采集 38 张图像。  检查灌流系统，确保有足够的 HBS 维持至少再灌流 5 分钟，并保持灌流持续进行。  启动延时成像以开始去染色过程。
   
   
9. 去染色完成后，更改刺激设置，使图像 0 开始时给予 1200 个动作电位（10 Hz）（此最后步骤通常使用 1200 至 2000 个动作电位）。  关闭延时成像设置，采集单张图像以启动刺激。灌流应继续保持流动。  此步骤有助于清除残留的囊泡内 FM 染料，以确定背景荧光或“总可释放”荧光水平。  刺激结束后，关闭刺激设置，重新对焦目标区域。  关闭灌流和吸液，然后采集两张最终的背景图像。  可采集单张图像或 Z 层扫描图像（步长 0.5 µm）。  Z 层扫描有助于校正实验过程中焦平面的偏移。
   
   
10. 您的 FM 实验已完成。  若立即进行更多实验，每次实验之间应清洁物镜和腔室，但灌流装置可等到所有实验结束后再清洗。  彻底用水冲洗装置，然后用乙醇冲洗。

讨论

由于300个动作电位（APs）足以诱导至少一轮囊泡再循环，因此通常给予300个或更多的动作电位作为加载刺激，以标记再循环池中的囊泡。尽管更强的加载刺激（如900个APs）可能使少量额外的囊泡被标记，但这也会增加染料嵌入细胞外膜的时间，导致非特异性染色增强。我发现清洗步骤对于实现适当的脱染至关重要。灌流时流速应保持在每分钟1至1.5 mL，通常持续10 ± 2分钟。可在清洗开始约7分钟时采集单幅图像，以监测染料去除的程度。如有必要，可略微提高流速或延长清洗时间。在我们的实验中，清洗时间超过10至12分钟是不可取的，因为这会增加囊泡标记因自发胞吐事件而丢失的可能性，即使细胞处于静息状态时也可能发生此类事件。在脱染步骤中，施加900至1200个APs以释放所有被标记的囊泡。此外，通常再施加1200至2000个APs，以获得“可释放荧光”的基线值，用于对脱染数据进行归一化处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APV	Sigma-Aldrich	A5282
FM 4-64	Molecular Probes, Life Technologies	T-3166
CNQX 二钠盐	Sigma-Aldrich	C-239