海拉细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第3部分描述了通过氨基烯丙基偶联染料对宿主和病毒样本的扩增RNA进行荧光标记的过程。共3部分，第3部分。
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本文内容
摘要
摘要
该家族Poxviridae由大型双链DNA构成的病毒， exclusively在感染细胞的细胞质中复制。该科成员包括orthopox属包括天花病毒（variola），即人类天花的致病因子，猴痘病毒（monkeypox）以及痘苗病毒（vaccinia，VAC），后者是该病毒科的原型成员。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但它们在病毒生命周期中各自发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主与病毒基因表达的调控机制，我们采用了基因组范围的方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了痘苗病毒感染HeLa细胞的时间进程实验，并在感染后的多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。
方案
第1部分：aRNA标记：染料的氨基烯丙基偶联
- 将1µg的aRNA样品加入到1.5mL的微量离心管中。
- 在低温或不加热条件下真空干燥样品，直至完全干燥。样品一干燥立即盖上管盖——切勿过度干燥！
- 向每根管中加入9µl偶联缓冲液，轻轻涡旋震荡1分钟以重悬aRNA。短暂离心使样品沉降至管底，然后将样品置于冰上静置。
- 向每管Cy3或Cy5染料中加入22µl高纯度DMSO。一管染料足以用于2个样品。Cy3染料用于标记参考样品，Cy5染料用于标记待测样品。
- 涡旋混匀染料，充分混合。在使用前始终避光保存。染料配制时间不得早于使用前1小时。确保在任何阶段都无水分进入染料/DMSO混合液。
- 向每个样品中加入11µl已配制好的DMSO/Cy染料溶液，轻轻涡旋充分混匀。
- 室温孵育30–45分钟。用锡箔纸覆盖样品或将其置于抽屉中，以尽量减少光照暴露。
- 孵育结束后，向每个样品中加入4.5µl羟胺以终止反应。轻轻涡旋充分混匀。
- 再次于室温孵育15分钟。用锡箔纸覆盖样品或将其置于抽屉中，以尽量减少光照暴露。
第2部分：标记的aRNA纯化
- 使用前轻轻涡旋振荡RNA结合磁珠，以获得均匀的混合物。
- 在室温下配制aRNA结合混合液。 （表1）
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讨论
关键步骤
进行氨基烯丙基偶联时，必须在偶联前短时间内（少于1小时）用DMSO重新溶解染料，并确保水分不进入染料/DMSO混合物中，因为水会与染料上的活性基团发生反应。RNA不要过度干燥（可浓缩至1–2 µL，而非完全干燥），并充分重悬于偶联缓冲液中。偶联反应过程中，应将反应物避光保存，偶尔轻轻 flick（轻弹混匀），必要时可短暂离心。
应用/意义
本方案产生的标记RNA可用于与人源、病毒或定制的微阵列杂交，以评估培养细胞在感染后的基因表达应答。微阵列平台各不相同，因此请遵循制造商的说明，由标记探针制备杂交混合液。
利用定制设计的痘病毒芯片1，我们能够根据杂交信号出现的时间以及转录检测是否依赖病毒DNA复制，将基因分类为“早期”或“晚期”等大类。我们观察到每个时间类别中基因的预期功能类别（即预期的早期、中期和晚期基因），但在转录发生的具体时间上存在差异。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
怀特黑德研究所研究员基金
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| CyDye 标记后反应性染料套装 | 试剂 | GE Healthcare | RPN5661 | 包含 Cy3 和 Cy5 两种染料 |
| NanoDrop ND-1000 紫外-可见分光光度计 | 其他 | NanoDrop | ND-1000 | 或同等性能的分光光度计 |
参考文献
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickso....
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