海拉细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第3部分描述了通过氨基烯丙基偶联染料对宿主和病毒样本的扩增RNA进行荧光标记的过程。共3部分，第3部分。
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本文内容
摘要
摘要
该家族Poxviridae由大型双链DNA构成的病毒， exclusively在感染细胞的细胞质中复制。该科成员包括orthopox属包括天花病毒（variola），即人类天花的致病因子，猴痘病毒（monkeypox）以及痘苗病毒（vaccinia，VAC），后者是该病毒科的原型成员。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但它们在病毒生命周期中各自发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主与病毒基因表达的调控机制，我们采用了基因组范围的方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了痘苗病毒感染HeLa细胞的时间进程实验，并在感染后的多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。
方案
第1部分：aRNA标记：染料的氨基烯丙基偶联
- 将1µg的aRNA样品加入到1.5mL的微量离心管中。
- 在低温或不加热条件下真空干燥样品，直至完全干燥。样品一干燥立即盖上管盖——切勿过度干燥！
- 向每根管中加入9µl偶联缓冲液，轻轻涡旋震荡1分钟以重悬aRNA。短暂离心使样品沉降至管底，然后将样品置于冰上静置。
- 向每管Cy3或Cy5染料中加入22µl高纯度DMSO。一管染料足以用于2个样品。Cy3染料用于标记参考样品，Cy5染料用于标记待测样品。
- 涡旋混匀染料，充分混合。在使用前始终避光保存。染料配制时间不得早于使用前1小时。确保在任何阶段都无水分进入染料/DMSO混合液。
- 向每个样品中加入11µl已配制好的DMSO/Cy染料溶液，轻轻涡旋充分混匀。
- 室温孵育30–45分钟。用锡箔纸覆盖样品或将其置于抽屉中，以尽量减少光照暴露。
- 孵育结束后，向每个样品中加入4.5µl羟胺以终止反应。轻轻涡旋充分混匀。
- 再次于室温孵育15分钟。用锡箔纸覆盖样品或将其置于抽屉中，以尽量减少光照暴露。
第2部分：标记的aRNA纯化
- 使用前轻轻涡旋振荡RNA结合磁珠，以获得均匀的混合物。
- 在室温下配制aRNA结合混合液。 （表1）
- 充分涡旋混匀。
- 将aRNA洗脱缓冲液分装至1.5 mL离心管中，在50–60°C孵育至少10分钟。
- 向每个样本中加入70µl aRNA结合混合液，通过上下吹打3-4次充分混匀。
- 将样品从PCR板转移至96孔圆底板中。
- 向每个样本中加入50 µl的100%异丙醇，通过上下吹打3–4次充分混匀。
- 在轨道摇床上轻轻振荡平板至少2分钟，以充分混匀样品。
- 将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。保持培养板在磁力架上直至混合液变澄清，且结合用磁珠完全沉降。
- 使用真空吸管小心吸去上清液，注意不要扰动磁珠。或者，也可使用移液器小心移除上清液并弃去。此时，由于未结合的染料分子存在，上清液应呈亮粉色或亮蓝色。
- 从磁力架上取下培养板。
- 向每个孔中加入100 µl aRNA洗涤液，在摇床上以中等速度振荡1分钟。此步骤中磁珠可能未完全分散。
- 将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。
- 使用真空吸管小心吸去上清液，注意不要扰动磁珠。或者，也可用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。
- 从磁力架上取下培养板。
- 重复洗涤一次nd 用100 µl aRNA洗涤液洗涤。
- 2分钟后nd 洗涤后，在旋涡振荡器上以最大速度振荡平板1分钟以干燥磁珠。切勿过度干燥样品！
- 将20µl预热的aRNA洗脱缓冲液加入每个样品中，从磁珠上洗脱aRNA。
- 在轨道摇床上剧烈振荡平板3分钟，然后检查磁珠是否已充分分散。若未充分分散，则继续振荡。
- 磁珠完全分散后，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。上清液中含有纯化后的标记aRNA样本，颜色应为浅粉色或浅蓝色。
- 将洗脱的aRNA小心转移至新的PCR板（或PCR管）中。
- （可选步骤）使用NanoDrop分光光度计的微阵列模块，通过测量1.5 µl样品来检测RNA浓度及染料含量。
- 立即将标记的aRNA杂交至您选择的微阵列平台，或者，您也可以将标记的aRNA在–80°C保存，直至准备进行杂交。
表1 aRNA结合反应体系
| 试剂 | 单次反应所需用量 |
| RNA 结合磁珠* | 10µl |
| 磁珠重悬液* | 4µl |
| 100% 异丙醇** | 6µl |
| aRNA 结合缓冲液浓缩液 | 50µl |
*先将RNA结合磁珠与磁珠重悬液混合
**加入异丙醇并充分混匀，然后再加入aRNA结合缓冲液浓缩液。
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讨论
关键步骤
进行氨基烯丙基偶联时，必须在偶联前短时间内（少于1小时）用DMSO重新溶解染料，并确保水分不进入染料/DMSO混合物中，因为水会与染料上的活性基团发生反应。RNA不要过度干燥（可浓缩至1–2 µL，而非完全干燥），并充分重悬于偶联缓冲液中。偶联反应过程中，应将反应物避光保存，偶尔轻轻 flick（轻弹混匀），必要时可短暂离心。
应用/意义
本方案产生的标记RNA可用于与人源、病毒或定制的微阵列杂交，以评估培养细胞在感染后的基因表达应答。微阵列平台各不相同，因此请遵循制造商的说明，由标记探针制备杂交混合液。
利用定制设计的痘病毒芯片1，我们能够根据杂交信号出现的时间以及转录检测是否依赖病毒DNA复制，将基因分类为“早期”或“晚期”等大类。我们观察到每个时间类别中基因的预期功能类别（即预期的早期、中期和晚期基因），但在转录发生的具体时间上存在差异。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
怀特黑德研究所研究员基金
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| CyDye 标记后反应性染料套装 | 试剂 | GE Healthcare | RPN5661 | 包含 Cy3 和 Cy5 两种染料 |
| NanoDrop ND-1000 紫外-可见分光光度计 | 其他 | NanoDrop | ND-1000 | 或同等性能的分光光度计 |
参考文献
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
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- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
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重印与许可
