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Homarus americanus 口胃神经系统解剖

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DOI：

10.3791/1171

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2009年5月28日

 , 
1Volen Center for Complex Systems, Brandeis

本文内容

摘要

我们描述了从美洲龙虾（Homarus americanus）胃部精细分离口胃神经系统的方法。

摘要

为了理解神经系统如何产生活动并对外界环境作出反应，神经科学家们采用一些能够表现出感兴趣活动、且便于进行实验操作的模型系统。美国龙虾的口胃神经系统（STNS）Homarus americanus；也被称为大西洋龙虾或缅因龙虾，已被确立为研究节律产生网络及神经网络神经调制的模式系统。STNS 包含3个前部神经节（2个连合神经节和1个食管神经节），其中含有投射至口胃神经节（STG）的调节性神经元。STG 包含约30个神经元，组成两个中枢节律产生网络，即幽门网络和胃网络，这些网络是甲壳动物摄食行为的基础1,2. 虽然研究该系统是可行的in vivo3，当被分离时，STNS 仍能持续产生节律性活动in vitro. 在培养皿中将STNS进行物理分离，可方便地接触神经节中的胞体以进行细胞内电生理记录，同时便于接触STNS神经以进行细胞外记录。分离STNS分为两个步骤。第一步是将胃从动物体中解剖出来，该步骤在配套的视频文章中有详细描述。4. 在本视频文章中，采用精细解剖技术从胃部分离出STNS。该操作可获得可用于电生理记录的神经系统制备样本。

方案

在开始本方案之前，必须按照配套的 JoVE 文章（Bierman & Tobin, 2009）所述方法将龙虾的胃从动物体内取出并进行预处理。以下所述的大部分步骤均需在解剖显微镜下进行。

第一部分 - 分离联合神经节

  1. 将培养皿摆放，使胃的前端（靠近唇部）朝远离操作者的方向，后端（靠近幽门）朝向操作者。

  2. 确保胃已用图钉固定，使其尽可能平展地贴附在培养皿上。
    1. 在唇部两侧固定食管。
    2. 如有必要，调整在大体解剖过程中放置的其他图钉。
  3. 去除皮下组织。
    1. 在 gm2/gm3 肌肉附近夹住皮下组织，将其从这些肌肉上分离，并轻轻向头端方向牵拉。
    2. 用剪刀剪断皮下组织与下方脂肪之间的连接部分。在中央动脉周围操作时需格外小心，该动脉包裹着口胃神经系统的重要部分。在口胃神经节周围约 0.5 cm 半径范围内的皮下组织应保持完整，口胃神经节位于 gm1b 肌肉之间。
    3. 剪除已分离的皮下组织。
  4. 将脑组织与下方组织分离。
    1. 辨认从脑前部向两侧延伸至胃前部的两个较大的连合神经。
    2. 保持这些神经完整，用镊子轻轻提起脑组织，并进行剪切，使脑与其余组织分离。操作时需谨慎，因口胃神经位于脑下方，必须保持完整。
  5. 将连合神经节与周围组织分离。
    1. 沿一侧连合神经追踪至其中一个连合神经节。
    2. 辨认 ion 和 son 神经——这些神经必须保持完整。连合神经节会发出多条放射状神经，除 ion 和 son 外，其余大部分可剪断，但需保留一条额外神经附着，以固定连合神经节位置，便于完成后续解剖。
    3. 对另一侧连合神经节重复相同操作。
  6. 从外侧向内侧清理 ion 和 son 神经。保留唇神经完整，以将神经系统锚定于胃部。ion 神经交汇处即为食管神经节所在位置。可通过夹住下腹侧神经并向上牵拉，在其下方进行清理。

第二部分——分离口胃神经节（STG）及残留神经。

  1. 将STG从周围组织中分离出来。
    1. STG 位于一条动脉内，该动脉走行于 gm1b 肌肉之间，并延伸至 gm2a、b 肌肉。在 gm2a、b 肌肉附近寻找该动脉的切断端。
    2. 将动脉的切断端向上方和前方牵拉，以暴露 dvn继续向上剥离，直至达到残留皮下组织的水平。分离后，可将动脉修剪至与残留皮下组织相接触的水平。
    3. 切除位于龙虾吻部的肌肉瓣。
    4. 抬起动脉上方的皮下组织，观察到动脉在位于舌下腺上方的脂肪内形成一个通道。将剪刀的一个刀片插入动脉内，剪开其上方的肌肉。检查是否能够看到 dvn 在切割时，确保位于颞上回（STG）上方的安全位置。继续沿动脉向前方切割。当在颞上回上方进行切割时，你将能够看到 stn 从颞浅筋膜（STG）向前延伸并深入肌肉。继续向前切割，以完全分离位于STG上方的肌肉。
    5. 清除组织周围杂物 stn.
  2. 分离 agn来自周围组织。（即使您不打算从周围组织记录） agn，你需要保留一段完整的神经，以固定神经节进行细胞内记录。）
    1. 为了更清楚地观察 agns，去除剩余的皮下组织及下方肌肉的一薄层。
    2. 在颞上回后方不远处，于脂肪和肌肉中辨识出两侧的暗色管状结构 dvn.
    3. 将一把剪刀的一侧刀片插入隧道内，剪断神经上方的组织。沿神经继续向侧方剪开，以分离神经。（暴露足够固定神经节的几毫米即可，但至少暴露5 mm的神经） agn 如果你计划对其进行记录。
    4. 分离 agn 通过切断连接，从其支配的肌肉中分离。
    5. 另一侧重复操作以分离对侧 agn.
    6. 一旦两者均 agn将所有连接STG与胃的肌肉和组织切断。
  3. 分离 mvn它们是一对细小的神经，从两侧分出 lvn 并在脂肪下方横向穿行。
    1. 使用剪刀或两把镊子从一侧切开脂肪组织 dvn，靠近其分为两条分支的位置 lvns. 在这里，你已远离 mvn且不会冒损坏它们的风险。
    2. 抬起脂肪层，辨认出小的 mvn 位于下方。这些神经在 gm1b 肌肉水平的后方，由内侧向外侧走行。
    3. 去除上方的脂肪层 mvn暂时保留神经完整，以免缠绕。在解剖结束时，将从胃部外侧切断其末端。
    4. 在另一侧重复该过程以分离另一侧 mvn.
  4. 分离 lvn和后部神经。
    1. 从以下位置开始 lvn侧向分支出 dvn，遵循一个 lvn 通过切除此神经上方的脂肪组织。根据制备情况，有时可将神经上方的整层脂肪完全剥离。
    2. 继续揭示 lvn 直到该点 psn 分出分支。
  5. 分离 pyn.
    1. 定位 pyn它是一条沿幽门后方走行的神经。
    2. 去除覆盖该区域的薄层膜。
    3. 分离 pyn 通过切割幽门的一小部分，连同其附着处 pyn.
    4. 轻轻提起幽门部分，并剪除其两侧的组织 pyn 直到到达连接到的分支 pdn.
  6. 分离 pdn.
    1. 定位 pdn它是一条位于幽门扩张肌后侧并向后走行的神经。
    2. 切取一小段附着于幽门扩张肌的组织 pdn.
    3. 轻轻提起幽门扩张肌组织部分，剪除其两侧的组织 pdn 直到到达连接到的分支 pyn.
  7. 分离腹侧 lvn，连接 pyn 和 pdn 到 lvn.
    1. 在三角形分支点处 pyn 和 pdn 连接至腹侧 lvn，分离出从腹侧分支的任何微小神经节段 lvn，例如 vpln。这将用作牵拉腹侧的把手 lvn.
    2. 提起手柄，剪除腹侧两侧的组织 lvn，向前侧方向操作，直至到达指定位置 psn 分出分支。
  8. 重复步骤 10 至 13 以分离 lvn 另一侧的后部神经。

  9. 将口胃神经系统从胃部剥离。
    1. 完全解离 lvn 从胃部，拉动 psn 并切断所有与之相连的组织和神经 lvn 和腹侧 lvn，但以下情况除外 pdn 和 pyn. 在另一侧重复此步骤。
    2. 切取每侧的外侧端 mvn抬起外侧端，切断神经与下方胃组织之间的任何多余连接。
    3. 在前端，切断与连合神经节相连的任何多余组织，并在两侧分别切断唇神经。
    4. 目视扫描口胃神经系统，识别并切断与胃组织之间的任何额外连接。
    5. 抓住两条连合神经前端、连合神经节上方的位置，将口胃神经系统从胃部剥离并移至培养皿一侧。操作过程中，切断任何残留的连接组织，以完全游离该神经系统。
  10. 准备小型Sylgard培养皿。
    1. 在小培养皿的Sylgard表面充分摩擦一些胃组织。这将降低Sylgard的疏水性，使生理盐水能够在培养皿表面均匀分布。
    2. 用预冷的生理盐水冲洗并注满Sylgard培养皿。
  11. 用镊子夹住两侧的脑神经前段，将神经系统从大培养皿中提起，转移到已准备好的Sylgard小培养皿中。

  12. 使用微型图钉和从钨丝上截取的较细图钉，将STNS固定在小培养皿中。
    1. 通过检查腹侧室神经是否背离Sylgard，确保标本腹面朝上。
    2. 取出脑组织并固定连合神经。
    3. 轻轻牵拉神经系统的每一部分，使其绷紧并展平 psn向后方和侧方牵拉并固定。
    4. 移除幽门扩张肌 pdns，并固定 pdns.
    5. 移除幽门段 pyns，并固定 pyns.
    6. 固定任何残留的孤立神经，例如唇部神经， mvn和 agns.
  13. 剥离STG的鞘膜。
    1. 确保STG平整地贴在Sylgard上，并通过侧向拉紧固定 agns，前部 stn 和后部 dvn.
    2. 调整光照条件，以实现对轴突的清晰观察 dvn.
    3. 使用小针或细钨针，在包裹的鞘膜上制作一个微小的浅孔 dvn位于颞上回（STG）后方。
    4. 将针头沿 dvn在轴突背侧水平撕裂神经鞘。
    5. 抓住位于STG后方的神经鞘瓣膜，向前牵拉，以从STG背侧去除神经鞘。
缩写：
STNS口胃神经系统
STG口胃神经节
CoG连合神经节
stn口胃神经
mvn内侧腹侧神经
ion下食管神经
son上食管神经
agn前胃神经
dvn背侧腹侧神经
lvn外侧腹侧神经
psn后胃神经
vpln腹侧后外侧神经
pyn幽门神经
pdn幽门扩张神经

讨论

龙虾胃部和 STNS 的解剖结构此前已有详细描述5,6，该解剖方法的多种变体已在众多研究中被应用。我们建议在开始解剖操作前，先熟悉胃部5-7和 STNS5,8的解剖结构。掌握这些解剖知识将降低神经和组织意外受损的风险。

为保持制备物的健康状态，维持较低的温度至关重要。可通过每30分钟用保存在冰箱中的4˚C生理盐水更换一次溶液，轻松实现降温。当浸没在冷生理盐水中时，分离的STNS制备物可维持活性数小时。相关记录见下文 Homarus gammarus 已证明在5天内从STG记录到稳定的节律性活动 体外9；在类似情况下也观察到了稳健性 H. americanus（个人观察）.

来自联合神经节的调节性输入对于维持胃幽门神经节（STG）持续的运动模式至关重要。因此，为了保持正常的节律性活动，必须保留联合神经节以及 ion、son 和 stn 神经。我们所描述的解剖方法保留了多条运动神经（内含运动神经元轴突）：agns（包含胃磨肌（GM）轴突）、mvns（包含侧胃神经（LG）和下心脏神经（IC）轴突）、pyns（包含幽门神经元（PY）轴突）、pdns（包含幽门扩张神经（PD）轴突），以及 lvns（包含侧幽门神经（LP）、内侧胃神经（MG）、LPG 轴突，以及来自 GM、PD 和 PY 的轴突）。通过解剖额外（或不同的）神经，也可记录其他类型的运动神经元轴突。每种特定类型的运动神经元轴突均可通过分离并记录其支配相应肌肉的神经来进行单独记录。

该制备样品可用于多种聚焦于神经系统功能的研究。神经元的活动可通过细胞内记录方式，使用尖锐电极从胞体或轴突进行记录，也可通过细胞外记录方式从神经中记录电脉冲信号。STG神经元中的多种离子通道已实现部分克隆，并可从人工分离的胞体中检测其mRNA水平10,11。

致谢

我们谨向我们的导师 Eve Marder 博士致以谢意。本研究得到了美国国立卫生研究院基金项目 NS17813（授予 Eve Marder）和 NS059255（授予 A-E T）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细钨丝（0.001 英寸直径）工具California Fine Wire Company切成 1-2 毫米的小段，用作细针。
5 号镊子工具Fine Science Tools91150-20
微型针工具Fine Science Tools26002-10
Moria 弹簧剪刀（7 毫米刀片）工具Fine Science Tools15370-52此类为高端产品。同一家公司也提供更经济的弹簧剪刀。
培养皿（100×15 毫米）工具Fisher Scientific08-757-12加入 2-4 毫米厚的 Sylgard 182。
Sylgard 182其他Dow Corning182
针 holder工具Fine Science Tools26018-17可选。仅使用剪刀和精细镊子也可完成去鞘操作。
超细镊子 #5SF工具Fine Science Tools11252-00
钨针工具Fine Science Tools10130-05可选。去鞘操作可使用剪刀，或使用细钨丝切割制成的针完成。
解剖显微镜

参考文献

  1. Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).
  2. Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
  3. Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen. J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).
  4. Bierman, H. S., Tobin, A. E. Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus. J Vis Exp. 27, (2009).
  5. Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).
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  9. Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture. J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).
  10. Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals. Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).
  11. Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).

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