我们描述了一种简单的方案，用于鉴定与ATP门控P2X2受体全长C末端结合的脑蛋白。将该方法拓展并系统地应用于所有P2X受体，有望加深对P2X受体信号转导机制的理解。
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摘要
摘要
配体门控离子通道是神经系统中突触间通信的基础1。在哺乳动物中，存在三类配体门控通道：半胱氨酸环（cys loop）通道、谷氨酸门控通道以及P2X受体通道2。在这三类通道中，神经递质的结合均可导致通道孔道的开放，使离子顺着其电化学梯度跨膜流动。许多配体门控通道对钙离子也具有通透性3, 4，而钙离子可发挥下游信号转导作用5（例如基因调控），其效应持续时间可能远超通道开放本身。因此，配体门控通道可在从数毫秒到数天的广泛时间尺度上传递信号。鉴于其重要功能，有必要深入了解配体门控离子通道本身如何受到蛋白质的调控，以及这些调控蛋白如何调节信号转导过程。近期研究表明，可能大部分甚至所有通道都属于蛋白质信号复合物的一部分6。本文将阐述如何鉴定与P2X2受体胞内区C末端区域结合的蛋白质。
P2X 受体是一类由 ATP 门控的阳离子通道，由七个亚基（P2X1-P2X7）组成。P2X 受体在脑组织中广泛表达，介导兴奋性突触传递以及神经递质释放的突触前易化7。P2X 受体存在于可兴奋细胞和非可兴奋细胞中，在神经信号传导、炎症反应以及心血管功能中发挥关键作用8。P2X2 受体在神经系统中含量丰富9，是本研究的重点。每个 P2X 亚基被认为具有两个被胞外区域分隔的跨膜区段（TM1 与 TM2）7，以及胞内的 N 末端和 C 末端（图 1a）7。P2X 亚基10（P2X1-P2X7）在氨基酸水平上的序列同源性为 30-50%11。P2X 受体仅包含三个亚基，是离子型受体中结构最简单的化学计量比。P2X2 受体的 C 末端由 120 个氨基酸组成（图 1b），并包含多个蛋白质结合的保守位点，支持 P2X2 受体可能参与信号复合物形成的假说。然而，尽管已有研究赋予 P2X2 受体 C 末端多种功能9，但尚无研究描述通过全长 C 末端与该蛋白胞内侧结合的分子伴侣。在本方法学论文中，我们描述了一种蛋白质组学方法，用于鉴定与 P2X2 受体全长 C 末端相互作用的蛋白质。
方案
实验步骤
实验步骤（图2）包括以下四个部分，将按步骤逐一描述。
第1部分：P2X2受体C末端的亚克隆与表达。
我们已在细菌中表达了P2X2受体的全长C末端，以鉴定与其结合的脑蛋白。
- 通过 PCR 扩增 P2X2 受体的 C 末端（残基 353-472）（图 1），将其克隆至 pGEX 4NT1 载体（GE Life Sciences）中，并通过测序验证。
- 将重组质粒转化至 E. Coli (BL21) 中以表达重组蛋白。
- 用无菌移液枪头刮取含 P2X2 CT-GST 质粒的细菌甘油菌（E. coli BL21），接种于 5 ml 含适当选择性标记物（50 µg/ml 氨苄青霉素）的 Luria-Bertani（LB）培养基中，并在 37°C 摇床中过夜培养。
- 将过夜培养的菌液按 1:50 接种至 250 ml 含适当抗生素（50 μg/ml 氨苄青霉素）的 LB 培养基中，在 37°C、250 rpm 条件下振荡培养 2-3 小时，直至 600 nm 处光密度达到约 0.6-0.7。
- 加入 1 mM IPTG 诱导表达，并在 37°C 继续培养 3 小时以表达目标蛋白。
- 在 4°C 条件下以 5000 g 离心 15 分钟收集菌体（保留 1 ml 培养物用于分析表达水平，标记为“诱导后”）。弃去上清，沉淀用 20 ml STE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 8.0）重悬。
- 将悬浮液在 50 ml 离心管中以 5000 g 离心 15 分钟，弃去上清，将半干沉淀于 -70°C 冻存过夜。
- 将 -70°C 冻存的沉淀用 40 ml 冰冷裂解缓冲液（2%（w/v）月桂酰肌氨酸钠，15 mg 溶菌酶，150 mM NaCl，50 mM Tris，pH 7.5，5 mM DTT，以及一片完全蛋白酶抑制剂）重悬，并在冰上孵育 30 分钟。在此期间，将 3 ml 谷胱甘肽-Sepharose 4B 珠粒用 20 ml 磷酸盐缓冲盐水（PBS）和 20 ml T-PBS（含 0.1%（v/v）Triton X-100 的 PBS）各洗涤一次，最后再用 PBS 洗涤一次，然后将珠粒重悬于 1 ml PBS 中。
- 细菌悬液在液氮中反复冻融 3 次，随后在冰上进行超声处理（开 1 秒/关 1 秒，振幅 30 微米，持续 3 分钟），然后在冰上继续孵育 30 分钟，同时加入 4%（v/v）Triton X-100、10 mM MgSO4 和 2 mM ATP。
- 裂解液在 4°C 以 20000 g 离心 15 分钟，弃去沉淀（分别保留部分沉淀和 1 ml 上清用于 SDS-PAGE 检测胞质与膜组分中的蛋白含量）。将上清与珠粒在 4°C 孵育 1 小时（或过夜）。
- 以 500 g 离心 5 分钟收集珠粒，弃去上清（保留样品用于未结合组分检测）。珠粒用 T-PBS 洗涤 5 次（每次洗涤液保留用于洗涤对照）。
- 将珠粒重悬于 PBS 中制成 50%（w/v）的悬液，4°C 冰箱保存备用。蛋白浓度采用 Bradford 法测定（按制造商说明书操作）。
第2部分：全脑裂解液的制备
已知P2X2受体在脑组织中高表达8。在本研究中，我们旨在从大鼠全脑裂解液中鉴定与P2X2受体相互作用的蛋白质（图3）。
- 按照加州大学洛杉矶分校（UCLA）IAACUC批准的方案以及《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》的规定处死成年大鼠并取出脑组织，立即用预冷的 PBS 缓冲液（冰上）清洗 3 次。
- 为了裂解细胞，向所获取的脑组织中加入 10 ml 冰冷裂解缓冲液（体积约为所获脑组织湿重的 5 倍），缓冲液成分如下：150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM PMSF、5 μg/ml 亮抑酶肽、1% (v/v) NP-40，并加入一片蛋白酶抑制剂混合物片剂。
- 在冰上使用玻璃 Dounce 匀浆器对脑组织进行匀浆，直至形成均一稳定的混合物。
- 将细胞裂解液在 2000 g 条件下离心 5 分钟，以去除未破碎的细胞；收集上清液后，再于 29000 g 离心 60 分钟，以去除完整的细胞器和膜聚集体。
- 离心完成后立即转移上清液至洁净离心管中，采用 Bradford 法测定全脑裂解液的蛋白浓度（通常约为 ~15 mg/ml）。
- 将裂解液分装后于 -70°C 保存。
第3部分：分离P2X2 C端尾部相关蛋白
为了鉴定P2X2 CT-GST在全脑裂解液中的结合蛋白，采用将CT-GST固定于谷胱甘肽-Sepharose 4B珠粒上的pull down实验作为诱饵。对照组使用结合在珠粒上的单独GST。
- 脑组织裂解液在 4°C 下用 GST 琼脂糖珠预清除 1 小时。弃去沉淀，上清液用于后续分析。
- 将等量结合在谷胱甘肽 Sepharose 4B 珠上的 GST 和 P2X2 CT-GST（各 10 μg）与 100 µg 经预清除的溶解态大鼠全脑裂解液蛋白在裂解缓冲液中于 4°C 旋转孵育过夜。
- 珠子在 1000 g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 珠子用裂解缓冲液洗涤一次，随后在改良的 Laemli 缓冲液 [4% (w/v) SDS、10% (v/v) 2-巯基乙醇、2% (v/v) 甘油、0.004% (w/v) 溴酚蓝和 0.125 M TrisCl pH 6.8] 中煮沸 5 分钟。
- 样品在 5000 g 离心 5 分钟，上清液进行 10% SDS-PAGE 分离（图 4）。凝胶使用 SYPRO® Ruby 蛋白凝胶染色剂（按照生产商说明）染色，并在紫外光下观察。将 P2X2 CT 相关蛋白与使用 GST-null 作为诱饵蛋白所获得的蛋白进行比较。共进行四次生物学重复实验（即四个脑组织样本及四次独立的 pull-down 实验）。
第4部分：蛋白质的鉴定。
通过凝胶电泳分离的蛋白质从凝胶中切下，并通过质谱法进行鉴定12。注意：整个操作过程中必须避免灰尘，以减少角蛋白污染。实验人员应始终佩戴口罩、头套和手套，且在未戴手套时切勿接触目标凝胶区域。
- 从P2X2下拉实验中回收的所有可见蛋白质条带均用洁净的剃刀切下并切成小块（图4）。同样，也将GST-null下拉实验泳道中凝胶的相应区域以相同方式切下，无论其是否有条带染色（特异性结合GST-null诱饵的条带也被切下并鉴定），以确保不会遗漏染色灵敏度以下水平存在的蛋白质。
- 将凝胶小块置于含有200 μl 50 mM碳酸氢铵和50%（v/v）乙腈（ACN）的溶液中，涡旋振荡15分钟（室温）。重复此洗涤步骤一次。
- 加入200 μl乙腈使凝胶小块脱水（凝胶小块应收缩并变为不透明状）。
- 去除乙腈，并将凝胶小块在真空浓缩仪中干燥约10分钟。
- 随后将凝胶小块与30 μl新配制的10 mM DTT/10 mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）溶液（体积足以浸没凝胶小块）孵育，在56°C水浴中静置30分钟。
- 弃去DTT溶液，加入100 μl含50%乙腈的500 mM碳酸氢铵溶液，用碳酸氢铵溶液洗涤凝胶切片。
- 吸除洗涤液，加入200 μl乙腈以进一步脱水凝胶。
- 去除乙腈后，加入100 μl新配制的100 mM碘乙酰胺溶液，用于烷基化游离巯基。该步骤在室温避光条件下进行25分钟。
- 去除碘乙酰胺溶液，用200 μl含50 mM碳酸氢铵和50%乙腈（pH 8.0）的溶液涡旋洗涤凝胶小块2分钟。重复此洗涤步骤一次。
- 去除洗涤液后，将凝胶小块与200 μl乙腈孵育，随后通过真空浓缩仪去除乙腈约10分钟。
- 此时凝胶小块已准备好进行胰蛋白酶消化。将凝胶小块与30 μl胰蛋白酶溶液（工作浓度为20 ng/μL）孵育，并置于冰上10分钟，使凝胶充分溶胀。吸除多余胰蛋白酶溶液后，向再水化的凝胶颗粒中加入30 μl 50 mM碳酸氢铵溶液以保持其在整个消化过程中完全浸没，消化反应在37°C下持续进行12至16小时。
- 加入5 μl 5%（v/v）甲酸以灭活胰蛋白酶并终止消化反应。
- 将管子涡旋振荡约15分钟，短暂离心使液体沉至管底，然后转移至洁净并标记好的0.5 ml样品瓶中。
- 接着向凝胶小块中加入30 μl含0.1%（v/v）甲酸的50%乙腈溶液，刚好覆盖凝胶，随后涡旋振荡两次，每次10–15分钟，中间进行短暂离心。此步骤重复一次，每次更换甲酸-乙腈溶液。
- 收集最终液体，并将所有提取液合并至同一小瓶中。使用真空浓缩仪将体积浓缩至约30 μL。样品现可进行反相纳米液相色谱分析，并通过质谱进行蛋白质鉴定。在此特定示例中，该步骤在ThermoFisher公司的Orbi-trap串联质谱仪上完成（选择该仪器因其具有高质荷比精度、快速的蛋白质检测循环周期以及总体稳定的运行性能），尽管其他型号或厂商的仪器也可轻松结合前述方法使用。
- 以下简要介绍质谱分析的详细参数与筛选标准。所有肽段均通过反相纳米液相色谱（Eksigent）分离，并以3 μl/min的流速加载至C18反相柱上。流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流动相B为含0.1%甲酸和20%水的乙腈溶液。肽段以220 nl/min的流速洗脱，采用线性梯度程序：90分钟内从5% B升至50% B，随后5分钟内升至95% B，最后维持95% B持续5分钟。数据采集采用数据依赖模式，Orbi-trap用于MS扫描，LTQ用于MS/MS扫描。使用集成于Bioworks软件包中的SEQUEST算法，在大鼠IPI数据库（版本3.53）中对谱图进行搜索以鉴定肽段。每条肽段需满足以下标准：XCorr ≥2（+1电荷）、≥3（+2电荷）、≥4（+3电荷），且DeltaCN > 0.1。所有用于蛋白质鉴定的谱图均经人工检查，若鉴定出的肽段少于两条，则不接受该蛋白质。仅当蛋白质在四次P2X2下拉实验中均被检出，而在GST-null下拉实验中均未出现时，才纳入后续分析。
图1. P2X2受体亚基的示意图。A. 图示为P2X2受体亚基的拓扑结构。胞质区包含N端和C端。本研究中使用P2X2受体的C端（红色）作为下拉实验的诱饵。B. 本研究中使用的P2X2受体C端的氨基酸序列。
图2. 蛋白质表达、纯化、免疫共沉淀及鉴定实验方案的流程图与时间线。 我们展示了该实验方案的总体流程及相应时间安排。成年大鼠脑组织裂解液在进行免疫共沉淀实验前新鲜制备并立即使用。
图3. 大鼠脑组织中P2X2受体C末端网络的二元蛋白质组学分析示意图。 将与GST蛋白融合并结合到GST磁珠上的P2X2受体C末端用于下拉实验。制备脑组织裂解液，并将蛋白与固定化的重组蛋白孵育。未结合的组分用裂解缓冲液洗涤。通过质谱分析鉴定所结合的蛋白质。
图4. P2X2受体C末端结合蛋白的鉴定。 Sypro染色凝胶显示了一组与GST融合的受体C末端相互作用的候选蛋白（蓝色框）。同时展示了仅GST（黄色框）和仅谷胱甘肽Sepharose珠子的对照泳道。箭头指示了被切下并用于质谱进一步分析的独特条带示例。
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讨论
离子通道是一类重要的整合膜蛋白。它们含有充满水的孔道，可选择性地允许离子顺着其电化学梯度跨质膜移动。离子通道在开放状态和关闭状态之间进行门控。门控行为可由递质（例如ATP）触发，如P2X配体门控离子通道的情况，也可通过与其他蛋白质的相互作用进行调控。过去十年中，我们对P2X受体如何结合ATP13的理解不断加深，但辅助蛋白在调控P2X功能中的作用仍知之甚少。本实验方案所描述的方法旨在通过检测与P2X2受体胞内C末端相互作用的蛋白质（作为第一步），来鉴定P2X2受体形成的信号复合物。完整绘制P2X2受体信号复合物的图谱，将有助于深入理解这些引人入胜的离子通道的病理生理学机制。
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致谢
SW 和 TMV 由美国国立卫生研究院下属的国家研究资源中心（NCRR）和国家心肺血液研究所（NHLBI）资助。BSK 和 HS 由美国国立卫生研究院下属的国家神经疾病与中风研究所（NINDS）和国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 乙腈 | 试剂 | JT Baker | 9829-02 | |
| 丙烯酰胺 | 试剂 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| 氨苄青霉素 | 试剂 | VWR international | VW1507-01 | |
| 碳酸氢铵 | 试剂 | Fluka | 09830 | |
| 过硫酸铵 (APS) | 试剂 | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 三磷酸腺苷 (ATP) | 试剂 | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford 试剂 | 试剂 | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 溴酚蓝 | 试剂 | Fisher Scientific | B-392 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | 试剂 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | 试剂 | EMD Millipore | 3860 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | 试剂 | VWR international | VW1474-01 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸 (EGTA) | 试剂 | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| 甲酸 | 试剂 | EMD Millipore | 11670-1 | |
| 谷胱甘肽 Sepharose 4B 微球 | 试剂 | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| 盐酸 (HCl) | 试剂 | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) | 试剂 | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| 碘乙酰胺 | 试剂 | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| LB 培养基 (Luria-Bertani 培养基) | 试剂 | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| 亮抑酶肽 | 试剂 | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| 溶菌酶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| 硫酸镁 (MgSO4) | 试剂 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 氯化钠 (NaCl) | 试剂 | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 氟化钠 (NaF) | 试剂 | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| 正钒酸钠 (Na3VO4) | 试剂 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | 试剂 | Fluka | 74385 | |
| 苯甲基磺酰氟 (PMSF) | 试剂 | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| 蛋白酶抑制剂片 | 试剂 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 蛋白标准品 | 试剂 | Bio-Rad | 161-0305 | |
| 十二烷基肌氨酸钠 (Sarkosyl) | 试剂 | Acros Organics | 61207 | |
| 螺口小瓶 | 工具 | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| 十二烷基硫酸钠 | 试剂 | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby 蛋白凝胶染色剂 | 试剂 | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 (TEMED) | 试剂 | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris 碱 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 吐温 X-100 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 胰蛋白酶 | 试剂 | Promega Corp. | V5111 | |
| 吐温 20 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| 水 | 试剂 | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap 串联质谱仪 | 工具 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| 纳米液相色谱系统 | 工具 | Eksigent | ||
| β-巯基乙醇 (B-Mercapt–thanol) | 试剂 | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 甘油 | EMD Millipore | GX0185-6 |
参考文献
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重印与许可
