我们描述了一种简单的方案，用于鉴定与ATP门控P2X2受体全长C末端结合的脑蛋白。将该方法拓展并系统地应用于所有P2X受体，有望加深对P2X受体信号转导机制的理解。
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摘要
摘要
配体门控离子通道是神经系统中突触间通信的基础1。在哺乳动物中，存在三类配体门控通道：半胱氨酸环（cys loop）通道、谷氨酸门控通道以及P2X受体通道2。在这三类通道中，神经递质的结合均可导致通道孔道的开放，使离子顺着其电化学梯度跨膜流动。许多配体门控通道对钙离子也具有通透性3, 4，而钙离子可发挥下游信号转导作用5（例如基因调控），其效应持续时间可能远超通道开放本身。因此，配体门控通道可在从数毫秒到数天的广泛时间尺度上传递信号。鉴于其重要功能，有必要深入了解配体门控离子通道本身如何受到蛋白质的调控，以及这些调控蛋白如何调节信号转导过程。近期研究表明，可能大部分甚至所有通道都属于蛋白质信号复合物的一部分6。本文将阐述如何鉴定与P2X2受体胞内区C末端区域结合的蛋白质。
P2X 受体是一类由 ATP 门控的阳离子通道，由七个亚基（P2X1-P2X7）组成。P2X 受体在脑组织中广泛表达，介导兴奋性突触传递以及神经递质释放的突触前易化7。P2X 受体存在于可兴奋细胞和非可兴奋细胞中，在神经信号传导、炎症反应以及心血管功能中发挥关键作用8。P2X2 受体在神经系统中含量丰富9，是本研究的重点。每个 P2X 亚基被认为具有两个被胞外区域分隔的跨膜区段（TM1 与 TM2）7，以及胞内的 N 末端和 C 末端（图 1a）7。P2X 亚基10（P2X1-P2X7）在氨基酸水平上的序列同源性为 30-50%11。P2X 受体仅包含三个亚基，是离子型受体中结构最简单的化学计量比。P2X2 受体的 C 末端由 120 个氨基酸组成（图 1b），并包含多个蛋白质结合的保守位点，支持 P2X2 受体可能参与信号复合物形成的假说。然而，尽管已有研究赋予 P2X2 受体 C 末端多种功能9，但尚无研究描述通过全长 C 末端与该蛋白胞内侧结合的分子伴侣。在本方法学论文中，我们描述了一种蛋白质组学方法，用于鉴定与 P2X2 受体全长 C 末端相互作用的蛋白质。
方案
实验步骤
实验步骤（图2）包括以下四个部分，将按步骤逐一描述。
第1部分：P2X2受体C末端的亚克隆与表达。
我们已在细菌中表达了P2X2受体的全长C末端，以鉴定与其结合的脑蛋白。
- 通过 PCR 扩增 P2X2 受体的 C 末端（残基 353-472）（图 1），将其克隆至 pGEX 4NT1 载体（GE Life Sciences）中，并通过测序验证。
- 将重组质粒转化至 E. Coli (BL21) 中以表达重组蛋白。
- 用无菌移液枪头刮取含 P2X2 CT-GST 质粒的细菌甘油菌（E. coli BL21），接种于 5 ml 含适当选择性标记物（50 µg/ml 氨苄青霉素）的 Luria-Bertani（LB）培养基中，并在 37°C 摇床中过夜培养。
- 将过夜培养的菌液按 1:50 接种至 250 ml 含适当抗生素（50 μg/ml 氨苄青霉素）的 LB 培养基中，在 37°C、250 rpm 条件下振荡培养 2-3 小时，直至 600 nm 处光密度达到约 0.6-0.7。
- 加入 1 mM IPTG 诱导表达，并在 37°C 继续培养 3 小时以表达目标蛋白。
- 在 4°C 条件下以 5000 g 离心 ....
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讨论
离子通道是一类重要的整合膜蛋白。它们含有充满水的孔道，可选择性地允许离子顺着其电化学梯度跨质膜移动。离子通道在开放状态和关闭状态之间进行门控。门控行为可由递质（例如ATP）触发，如P2X配体门控离子通道的情况，也可通过与其他蛋白质的相互作用进行调控。过去十年中，我们对P2X受体如何结合ATP13的理解不断加深，但辅助蛋白在调控P2X功能中的作用仍知之甚少。本实验方案所描述的方法旨在通过检测与P2X2受体胞内C末端相互作用的蛋白质（作为第一步），来鉴定P2X2受体形成的信号复合物。完整绘制P2X2受体信号复合物的图谱，将有助于深入理解这些引人入胜的离子通道的病理生理学机制。
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致谢
SW 和 TMV 由美国国立卫生研究院下属的国家研究资源中心（NCRR）和国家心肺血液研究所（NHLBI）资助。BSK 和 HS 由美国国立卫生研究院下属的国家神经疾病与中风研究所（NINDS）和国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 乙腈 | 试剂 | JT Baker | 9829-02 | |
| 丙烯酰胺 | 试剂 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| 氨苄青霉素 | 试剂 | VWR international | VW1507-01 | |
| 碳酸氢铵 | 试剂 | Fluka | 09830 | |
| 过硫酸铵 (APS) | 试剂 | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 三磷酸腺苷 (ATP) | 试剂 | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford 试剂 | 试剂 | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 溴酚蓝 | 试剂 | Fisher Scientific | B-392 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | 试剂 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | 试剂 | EMD Millipore | 3860 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | 试剂 | VWR international | VW1474-01 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸 (EGTA) | 试剂 | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| 甲酸 | 试剂 | EMD Millipore | 11670-1 | |
| 谷胱甘肽 Sepharose 4B 微球 | 试剂 | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| 盐酸 (HCl) | 试剂 | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) | 试剂 | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| 碘乙酰胺 | 试剂 | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| LB 培养基 (Luria-Bertani 培养基) | 试剂 | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| 亮抑酶肽 | 试剂 | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| 溶菌酶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| 硫酸镁 (MgSO4) | 试剂 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 氯化钠 (NaCl) | 试剂 | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 氟化钠 (NaF) | 试剂 | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| 正钒酸钠 (Na3VO4) | 试剂 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | 试剂 | Fluka | 74385 | |
| 苯甲基磺酰氟 (PMSF) | 试剂 | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| 蛋白酶抑制剂片 | 试剂 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 蛋白标准品 | 试剂 | Bio-Rad | 161-0305 | |
| 十二烷基肌氨酸钠 (Sarkosyl) | 试剂 | Acros Organics | 61207 | |
| 螺口小瓶 | 工具 | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| 十二烷基硫酸钠 | 试剂 | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby 蛋白凝胶染色剂 | 试剂 | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 (TEMED) | 试剂 | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris 碱 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 吐温 X-100 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 胰蛋白酶 | 试剂 | Promega Corp. | V5111 | |
| 吐温 20 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| 水 | 试剂 | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap 串联质谱仪 | 工具 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| 纳米液相色谱系统 | 工具 | Eksigent | ||
| β-巯基乙醇 (B-Mercapt–thanol) | 试剂 | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 甘油 | EMD Millipore | GX0185-6 |
参考文献
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
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