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ES细胞来源的神经上皮细胞培养

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DOI：

10.3791/118

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2006年11月30日

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

利用基质细胞衍生诱导活性（SDIA）从胚胎干细胞（ES细胞）中诱导生成神经上皮前体细胞。

摘要

胚胎干细胞（ES细胞）具有分化为所有胚层来源细胞的潜能，使其成为开发新疗法的有力工具。通常，ES细胞的分化遵循先生成未成熟前体细胞，再进一步扩增并分化为成熟细胞表型的策略。这一策略同样适用于ES细胞来源的神经发生过程，其中神经细胞的发育主要包括两个阶段：首先获得并扩增未成熟的神经上皮前体细胞，随后将其分化为成熟的神经细胞。一种常用的从ES细胞生成神经前体细胞的方法是基于拟胚体（embryoid body, EB）的形成，该方法可诱导包括神经外胚层在内的所有胚层细胞的分化。另一种更为高效的方法是利用基质细胞衍生诱导活性（stromal cell-derived inducing activity, SDIA），通过将ES细胞与颅骨骨髓来源的基质细胞共培养实现（1）。无论是EB形成还是SDIA方法，均可观察到玫瑰花环样结构的出现，这些结构被认为类似于神经管和/或神经嵴样前体细胞。神经前体细胞可通过特定的培养条件进行分离、扩增，并进一步分化为特定类型的神经元和胶质细胞。本文中，我们描述了在与基质细胞系MS5共培养实验中，此类玫瑰花环样结构的生成与分离方法（2-5）。

方案

步骤 1

  1. 在明胶包被（0.01% 处理 30 分钟）的 6 孔板中，以 70,000/cm² 的密度将经丝裂霉素 C（10 µg/ml，处理 2.5 小时）抑制生长的 MS5 细胞接种于 α-MEM 培养基中。
  2. 当细胞贴壁并形成单层（过夜培养）后，更换为 SRM 培养基。
  3. 使用带有 27½ G 针头的注射器从胚胎干细胞（ES 细胞）培养物中手动分离 ES 细胞克隆。
  4. 用 1 ml 蓝色枪头小心吹打克隆，并以低密度接种于 MS5 细胞上（通常每 6 孔板接种 2–3 个克隆）。

注意：ES 细胞也可通过使用胶原酶或胰蛋白酶进行酶消化传代获得。

步骤 2

  1. 将ES细胞在MS5饲养层上培养14-21天，直至形成含有玫瑰花结结构的克隆集落。


注意：经常更换培养基。类胚体通常位于克隆的外缘，若在SRM中添加300–500 ng/ml Noggin，可显著促进其形成（3）。在某些分化方案中，SRM可替换为N2-A培养基，并补充生长因子或其他因子以促进细胞定向分化（2–5）。

步骤 3

  1. 在显微镜下使用27½ G针分离并挑选莲座状组织。

注意：避免切割和挑取MS5基质细胞。如果集落中玫瑰花环结构密集，也可分离整个集落。


步骤 4

  1. 用1 ml蓝色枪头小心吸取玫瑰花环样细胞簇，轻轻吹打重悬后，接种于预先用多聚-L-鸟氨酸（0.001%）和纤连蛋白（1 µg/ml）或层粘连蛋白（1 µg/ml）包被的6孔板中，培养基为N2-A培养基，通常添加bFGF（20 ng/ml）。细胞将重新形成并扩增玫瑰花环样结构。

注意：为了提高细胞存活率，可将小细胞簇以液滴形式接种，以增加细胞密度。也可通过在N2-A培养基中添加额外的生长因子或其他因子以促进细胞定向分化，对此步骤进行优化（2-5）。

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讨论

本方案展示了利用基质细胞衍生诱导法（SDIA）从人胚胎干细胞（ES细胞）生成并分离神经上皮细胞的各个步骤。该方法具有多种应用，已被广泛用于多种方案中以产生特定类型的神经元（例如参考文献1, 2, 5-9）。所形成的玫瑰花环样结构被认为类似于具有前部表型的神经管细胞（参考文献2, 5, 10），并含有神经嵴前体细胞（参考文献11, 12）。此外，这些细胞仍保留一定程度的可塑性，可在特定培养条件下通过特定因子进行模式化诱导。因此，由SDIA获得的神经前体细胞能够分化为中枢和周围神经系统中的多种细胞类型，使其成为在ES细胞分化研究范式中获取不同神经细胞群体的有力工具。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
L-谷氨酰胺GIBCO, by Life Technologies25030
α-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
青霉素/链霉素GIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Knockout 血清替代物GIBCO, by Life Technologies10828
MEM 非必需氨基酸溶液GIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
N2-A 添加剂Stem Cell Technologies07152
丝裂霉素-CSigma-AldrichM0503
明胶A型Sigma-AldrichG1890
聚-L-鸟氨酸Sigma-AldrichP49570.01% 溶液
层粘连蛋白Sigma-AldrichL-2020
纤连蛋白Sigma-AldrichF2006
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）Invitrogen13256
1 mL 注射器，配27½ G针头BD Biosciences309623
N2-A 培养基培养基DMEM/F12 + 1% N2-A 添加剂
血清替代培养基（SRM）培养基Knockout-DMEM + 20% Knockout 血清替代物 + 1% MEM 非必需氨基酸溶液 + 2 mM L-谷氨酰胺
α-MEM 培养基培养基α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-谷氨酰胺 + 1% 青霉素/链霉素
MS5细胞系基质细胞
显微镜
6孔板用于组织培养

参考文献

  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
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