成年斑马鱼内耳感觉上皮是研究成年脊椎动物毛细胞再生机制的良好模型系统。本方案展示了对感觉上皮的精细解剖过程，通过该方法可获得组织样本，用于在细胞和亚细胞水平上研究再生事件。
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本文内容
摘要
摘要
内耳中的神经感觉上皮是听觉和平衡功能的关键结构。因此，了解这些上皮的细胞与分子特征非常重要，这些上皮主要由两种细胞组成：毛细胞（HCs）和支撑细胞（SCs）。本研究选择成年斑马鱼的内耳感觉上皮作为研究对象，不仅因为所有已研究的脊椎动物中上皮结构高度保守，还因为成年斑马鱼具有再生毛细胞的能力，而哺乳动物在出生后不久便失去了这一能力。我们利用成年斑马鱼的内耳作为模型系统，研究成年脊椎动物内耳毛细胞再生的机制，这些研究可能有助于临床上治疗因毛细胞丧失导致的人类听觉或平衡功能障碍。
本文展示了如何对成年斑马鱼内耳感觉上皮进行大体解剖和精细解剖。大体解剖可去除内耳周围的组织，有助于制备组织切片，从而观察感觉上皮的精细结构。精细解剖则可清除各个感觉上皮中的非感觉上皮组织，使我们能够在整体封片的上皮样本中便捷地观察整个上皮的异质性。
方案
第1部分：组织制备
- 使用缓冲的 MS-222（三卡因甲烷磺酸盐，0.03%）处死成年斑马鱼。
- 将鱼体断头，切除下颌，将头部腹侧朝上置于解剖垫上，并用昆虫针固定组织。在解剖显微镜下，用精细镊子去除颅骨腹侧的软组织，并撬开颅骨囊的腹侧部分。
- 将鱼头在4%多聚甲醛中4°C固定过夜。
- 用PBS（磷酸盐缓冲液，1X）清洗固定后的鱼头，每次5分钟，共清洗3次。
第2部分：内耳的大体解剖
- 将鱼头腹面朝上放置在解剖垫上，并用昆虫针固定。后续所有步骤均在解剖显微镜下进行。
- 使用一对精细镊子，移除覆盖内耳的颅骨，然后小心取出内耳组织：球囊、瓶囊和椭圆囊。球囊与瓶囊紧密相连，因此会一并被拉出；而位于球囊和瓶囊前方的椭圆囊则在解剖过程中很可能与其他感受器分离。
- 将内耳组织置于磷酸盐缓冲液（1X PBS）中。若无需进一步精细解剖，可用1X PBS冲洗组织2–3次，随后可用于其他实验，例如冷冻切片。
第3部分：内耳感觉上皮的精细解剖
- 可在洁净的载玻片上滴加一滴 PBS (1X) 进行精细解剖。
- 使用两对精细镊子将椭圆囊耳石从椭圆囊中取出，如需要，可用一对精细镊子和刀片将非感觉上皮组织及上皮的神经支配部分剪除。
- 在分离球囊和瓶囊上皮前，先移除瓶囊耳石，同时尽量保持整个球囊完整。将组织置于 PBS 液滴中，腹面朝上。用刀片小心地在球囊与瓶囊之间进行切割。如需要，可用精细镊子和刀片修剪多余的非感觉上皮组织及神经支配部分。
第4部分：感觉上皮中毛细胞的荧光染色
- 用 PBT（1×PBS 和 1% Triton X-100）冲洗感觉上皮 3 次，每次 5 分钟。
- 将上皮与荧光标记的鬼笔环肽（例如 Alexa Fluor 488 Phalloidin，1:1,000 稀释）在室温下孵育 30 分钟。
- 用 PBT 冲洗感觉上皮 3 次，每次 10 分钟。
- 将上皮用封片剂封固于载玻片上，并使用合适波长的滤光片在荧光显微镜下观察染色组织。
- 成功解剖和染色后，可在显微镜下观察到具有强毛细胞束染色的完整上皮（图 1）。
图1. 球囊感觉上皮中的毛细胞经Alexa Fluor 488 Phalloidin（绿色）染色。 组织样本的分离与染色方法如文中所述。在样本不同位置拍摄多张图像，并使用Adobe Photoshop 7.0拼接成图。
比例尺 = 150µm。
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讨论
在本实验方案中，我们描述了成年斑马鱼内耳感觉上皮的宏观与精细解剖方法，该方法可用于制备组织样本，以研究感觉上皮的细胞及亚细胞特征。
为了成功完成解剖操作，第一步——固定——至关重要。务必始终使用新配制的多聚甲醛溶液，因为陈旧的溶液会导致组织固定不足，从而在解剖过程中难以操作。然而，需注意避免过度固定，即不要将组织在固定液中放置过久，否则会影响解剖后免疫/组织化学染色的结果。此外，使用维护良好且尺寸合适的解剖工具同样关键，尤其是在进行精细解剖时。
该大体解剖方案也可用于获取内耳组织以提取组织特异性的DNA/RNA/蛋白质。在此情况下，应在鱼类处死后立即进行解剖，无需经多聚甲醛固定。此外，可采用某些常规方法以防止目标大分子降解。例如，在进行组织特异性RNA提取时，可将去除下颌的鱼头用RNAlater溶液（Ambion）冲洗后浸入其中进行浸泡。
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所的院内研究计划资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| MS222（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐） | 试剂 | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液，10X） | 试剂 | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 多聚甲醛 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| 曲拉通 X-100 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexa Fluor 488 标记鬼笔环肽 | 试剂 | Invitrogen | A12379 | |
| 含 DAPI 的 VECTASHIELD 硬封固介质 | 试剂 | Vector Laboratories | H-1500 | |
| 解剖显微镜 | 显微镜 | Nikon Instruments | SMZ1000 | |
| 昆虫针 | 工具 | Fine Science Tools | 26000-40 | |
| 剪刀 | 工具 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| 镊子 | 工具 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045 | |
| 针状刀片 | 工具 | Sharpoint | 78-6810 | |
| 荧光显微镜 | 显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| 解剖垫板 | 工具 | eNasco | SB07840M | |
| 斑马鱼 | 动物 | 多种来源 | n/a |
重印与许可
