活体斑马鱼胚胎大脑的共聚焦显微镜成像

摘要

在本视频中，我们演示了一种利用共聚焦显微镜在单细胞分辨率下对活体斑马鱼胚胎中发育中的脊椎动物大脑进行分析的方法。该方法包括对单细胞斑马鱼胚胎进行显微注射，随后对发育中的大脑进行固定和成像的技术流程。

摘要

在本视频中，我们展示了本实验室开发的一种方法，用于分析斑马鱼胚胎脑部弯曲和折叠过程中所需的细胞形态变化与重排（Gutzman 等，2008）。该分析为理解脊椎动物脑三维结构发育所依赖的细胞生物学基础提供了新的视角，并显著提升了我们研究神经管形态发生的能力。斑马鱼胚胎脑的成形始于受精后18小时（hpf），此时神经上皮内的脑室开始扩张。到24 hpf时，神经管形态发生的初始阶段已基本完成。采用本方法，可在受精后单细胞阶段向胚胎注射编码膜定位绿色荧光蛋白（memGFP）的mRNA。注射并孵育后，将处于18至24 hpf阶段的胚胎倒置固定于琼脂糖中，利用共聚焦显微镜进行成像。值得注意的是，斑马鱼胚胎具有高度透明性，是荧光成像的理想模型系统。尽管我们的分析主要集中于中脑-后脑边界及后脑区域，但该方法亦可扩展应用于斑马鱼其他区域的观察，成像深度可达80–100 μm。

方案

1. 准备注射用mRNA

1. 本实验所用的 mRNA 是由编码 CAAX-eGFP（memGFP）mRNA 的质粒转录而来。首先，按照 Gutzman 等人（2008 年）的方法对质粒进行线性化处理。
2. 然后使用 mMessage mMachine 试剂盒转录 memGFP mRNA。
3. 将获得的 mRNA 稀释至 1 μg/μl，分装后于 -80°C 保存。
4. 制备含 1% 琼脂糖的注射模具，模具中的凹槽宽度应与单细胞期胚胎的宽度一致。
5. 注射前一天，设置交配笼，将雄鱼与雌鱼隔开。
6. 注射当天，使用微量移液器拉针仪制备毛细玻璃注射针，以备注射使用。

2. 注射 mRNA

1. 注射当天，将一份浓度为 1μg/μl 的 memGFP mRNA 冰上解冻。
2. 用无菌水将 mRNA 按 1:5 比例稀释，终浓度为 200ng/μl，并置于冰上保存。
3. 用制备好的浓度为 200ng/μl 的 memGFP mRNA 向毛细玻璃针中加载 1μl。
4. 将装有 mRNA 的针头插入连接至气体驱动显微注射仪的显微操作器中。
5. 调节注射体积至 1nl。
6. 取出前一天已配对好的野生型斑马鱼交配盒中的隔离挡板。
7. 在胚胎产出后立即收集，并将其置于含胚胎培养液（Westerfield, 1995）的琼脂糖注射模具中，使单细胞朝向远离显微操作器的一侧。
8. 穿过卵膜和卵黄进行注射，使 mRNA 直接注入单细胞内。每次实验注射约 50 个胚胎。若细胞已发生分裂，则不应注射。
9. 将胚胎置于 28°C 的胚胎培养液中过夜孵育。

3. 胚胎的固定与成像

1. 为了固定和成像胚胎，在预定观察时间点前一小时，于体视显微镜下用镊子去除胚胎的绒毛膜。
2. 准备用于固定最多4个胚胎的载玻片。
   • 使用硅酮真空油脂将盖玻片密封在特制的2 mm厚塑料载玻片的底面，该载玻片中央有一个直径约1 cm的孔。
   • 用0.7%琼脂糖填充载玻片上的孔，静置约20分钟，直至凝固。
   • 琼脂糖凝固后，使用200 μl移液器吸头取出小块琼脂糖，形成用于固定每个胚胎的圆柱形孔洞。
3. 在解剖显微镜下，将胚胎放置于填充了琼脂糖的载玻片上。加入50 μl三卡因（tricaine）以麻醉胚胎（Westerfield, 1995）。
4. 用镊子将胚胎调整至琼脂糖中的圆柱形孔内，使脑部或目标区域紧贴下方的盖玻片。
5. 在琼脂糖中的胚胎上方覆盖另一张盖玻片，并用硅酮真空油脂密封固定。
6. 使用倒置式荧光激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜对胚胎进行成像。采用63倍或更高倍数物镜，以获取神经上皮内单个细胞的高分辨率图像。
7. 图像通过LSM软件导出为TIFF文件，并使用Photoshop进行分析。

4. 代表性结果/成果

图1显示了24小时斑马鱼中脑与后脑脑室之间神经上皮的代表性共聚焦图像。每个细胞均用膜结合型绿色荧光蛋白（GFP）标记。

图1. 注射memGFP的24小时受精龄斑马鱼胚胎的活体共聚焦成像。
(A) 24小时受精龄胚胎的神经上皮，每个细胞由GFP标记出轮廓。成像区域分隔中脑和后脑脑室（分别标记为M和H），形成中脑-后脑边界。

讨论

在本视频中，我们演示了一种将 mRNA 注射到单细胞斑马鱼胚胎中的方法。此处，我们使用编码膜定位 GFP 的 mRNA 来标记每个细胞。随后，我们展示了如何固定并以单细胞分辨率对发育中的脑部进行成像。该技术使我们能够研究一种新型的细胞形态变化——基底收缩，这种变化是中脑-后脑边界形成所必需的（Gutzman 等，2008）。对其他类似现象进行类似的分析，有望显著拓展我们对脊椎动物形态发生及其潜在细胞生物学机制的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SeaKem GTG 琼脂糖	试剂	Lonza Inc.	50027
3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）	试剂	Sigma-Aldrich	A-5040
毛细玻璃管	工具	Frederick Haer and Co.	30-30-1	硼硅酸盐 1.0 mm 外径 × 0.5 mm 内径/纤维 100 mm
硅脂真空润滑剂	试剂	VWR international	W0S717
镊子	工具	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl 移液器吸头	工具	USA Scientific, Inc.	111-0806	适用于 24 hpf 胚胎的合适规格。
mMessage mMachine 体外转录试剂盒	试剂	Ambion	AM1340	SP6 RNA 聚合酶
Zeiss LSM 510 激光共聚焦显微镜	显微镜	Carl Zeiss, Inc.
显微操作仪	工具	Narishige International
显微注射仪	工具	Harvard Apparatus	PLI-100
微电极拉制仪	工具	Sutter Instrument Co.