本文介绍了一种用于鉴定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中蛋白质复合物的新型定量蛋白质组学技术。在本研究中，我们结合使用了稳定同位素标记氨基酸（SILAC）方法、亲和纯化及串联质谱技术，高特异性地鉴定了内质网蛋白Scs2p的结合伴侣蛋白。
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本文内容
摘要
摘要
脂质是细胞膜的基本组成单元，不仅作为屏障并实现细胞过程的区室化，近年来还被发现是重要的细胞内信号分子。然而，与蛋白质不同，脂质是主要通过尚未充分阐明的非囊泡途径运输的小型疏水性分子，这类运输被认为发生在膜接触位点（MCSs）。MCSs 是内质网（ER）与特定细胞器（如质膜（PM））直接发生物理接触的区域。ER-PM MCSs 中的内质网部分富含脂质合成酶，提示脂质合成被定向至这些位点，表明 MCSs 在脂质运输中具有重要作用。酵母是研究 ER-PM MCSs 的理想模型，因其 MCSs 数量丰富（每个细胞超过1000个接触点），且在所有真核生物中具有保守性。揭示构成 MCSs 的蛋白质对于理解脂质在细胞内的运输机制及其作为信号分子的功能至关重要。我们发现一种名为 Scs2p 的内质网蛋白定位于 ER-PM MCSs，并对这些位点的形成具有重要作用。目前我们的研究重点是鉴定 Scs2p 的分子互作伙伴。传统上，蛋白质复合物的鉴定依赖于首先通过凝胶电泳分离纯化的蛋白质样品，随后对凝胶中的蛋白条带进行原位酶解，并利用质谱分析肽段。这种方法通常仅能检测到少量蛋白质，且在操作过程中蛋白质复合物可能暴露于变性或非生理条件下。为克服这些问题，我们采用了一种大规模定量蛋白质组学技术，以获得无偏倚且可量化的数据。我们利用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）技术，将重同位素标记的氨基酸整合至未标记对照菌株的蛋白质中。将等体积的标签菌株培养物与未标记的 SILAC 标记培养物混合后，在液氮中研磨裂解。随后进行亲和纯化以富集目标蛋白质复合物。最后，将蛋白质样品沉淀，准备用于高效液相色谱-串联质谱分析。最重要的是，对照菌株中的蛋白质被重同位素标记，在质谱中会产生可被定量的质荷比偏移，从而可与诱饵菌株中未标记的蛋白质进行比较，因此能够有效排除污染蛋白或非特异性结合蛋白。通过该方法，我们已鉴定出多个定位于 ER-PM MCSs 的新蛋白质。本文详细描述了我们的研究策略。
脂质，膜接触位点，内质网，质膜，Scs2p，SILAC，亲和纯化，定量蛋白质组学，酵母，非囊泡运输
方案
材料与方法
- 酵母菌株
- 本研究中使用的所有菌株均基于 BY4742 背景。SILAC 对照菌株（Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 和 arg4::G418）是通过将 arg4 缺失菌株（Mat a, his3, ura3, leu2 和 arg4::G418）与 BY4742（Mat alpha, his3, leu2, ura3 和 lys2）杂交，并通过四分体解剖获得减数分裂单倍体而构建的。因此，该对照菌株为赖氨酸和精氨酸营养缺陷型。诱饵菌株是通过基于载体 pBS1479 的 PCR 介导同源重组构建的。因此，本研究中使用的表位标签为串联亲和纯化（TAP）标签（3）。
- SILAC：
- SILAC 对照菌株在添加了 98% L-赖氨酸-4,4,5,5-D4（0.03 g/L，Cambridge Isotope）和 98% L-精氨酸-13C6（0.036 g/L，Cambridge Isotope）的最低缺失培养基中培养。
- 诱饵菌株则在含有正常同位素氨基酸的常规丰富培养基中培养。
- TAP 纯化的第一阶段［本方案改编自冷泉港实验室课程手册（4）］
**在纯化前一晚，将研钵和研杵置于 -80°C 冰箱中预冷。同时，将一个烧杯置于 -20°C 预冷**
在使用前立即配制以下缓冲液（适用于 1 L 培养物）：- 30 ml NP-40 缓冲液，含 25 µl 蛋白酶抑制剂混合物（PIC，1/2000）和 50 µl 1 M DTT
- 20 ml NP-40 缓冲液，含 1/200 PIC 和 50 µl 1 M DTT
- 10 ml TEV-C 缓冲液，含 1/2000 PIC 和 10 µl 1 M DTT
SILAC 及其制备
- 分别培养1L的诱饵菌株和对照菌株至OD600=1.0-1.3.
- 将培养物倒入500 ml Nalgene离心管中。平衡管重后，在2580×g下离心收集细胞。
- 弃去上清液，用50 ml冷的去离子水重悬沉淀2转移细胞至50 ml离心管中。离心收集细胞沉淀。**可将细胞沉淀于-80°C冻存**
- **重要** 按干菌体重量1:1配比，使对照菌株培养物与诱饵菌株培养物相匹配。
- 将每份细胞沉淀重悬于10 ml NP-40缓冲液中，其中含1:2,000蛋白酶抑制剂混合物（PIC）。
- 将一个试管中的两种细胞培养物直接倾倒至另一个试管中混合。
研磨
- 倒入液氮2 加入预冷的研钵中，待其完全蒸发。将2 ml细胞以环形方式加入研钵中。倒入少量液氮2 冷冻细胞。将细胞研磨至细粉状，重复此过程直至所有细胞均被研磨完毕。**切勿让细胞解冻。加入液氮**2 必要时**
- 将粉末转移至预冷的烧杯中，在室温下解冻。当边缘开始解冻时，加入20 ml含1/200 PIC的NP-40缓冲液。
- 将粗裂解液转移至40 ml Nalgene离心管中，在39000 ×g下离心30分钟。
- 等待期间，取 300 μl Sepharose 2B beads (GE)，用 300 μl NP-40 缓冲液（含 1/2,000 PIC）洗涤 3 次。将 beads 重悬于 300 μl 缓冲液中，制成 1:1 悬液。
预清除细胞裂解液
- 将上清液转移至新离心管中，并加入Sepharose 2B珠粒。在4°C旋转摇床上孵育30分钟。
- 等待期间，取 300 μl IgG Sepharose 6 布eads（GE），用 300 μl NP-40 缓冲液（含 1/2,000 PIC）洗涤 3 次。将 beads 重悬于 300 μl 缓冲液中，制成 1:1 悬液。
- 离心收集珠粒。将上清液转移至新离心管中。**保留一部分细胞裂解液用于后续 Western Blot 检测**
结合到IgG Sepharose珠
- 离心去除 Sepharose 2B 蛋白珠。加入预先制备好的 IgG 蛋白珠（1:1 悬浮液）。将混合物分装至两个离心管中，以提高结合效率。在4°C 冷室中于旋转平台上孵育 2 小时。
- 离心沉淀磁珠。**保留一份未结合组分的等分试样**
- 用10 ml NP-40缓冲液（1:2,000 PIC）洗涤磁珠。
- 用 3 ml TEV-C 缓冲液（含 1/2,000 PIC）洗涤磁珠。**保留一份磁珠等分试样，用于评估结合效率**
通过TEV蛋白酶切割从IgG磁珠中洗脱
- 向1 ml TEV-C缓冲液（含1/2,000 PIC）中加入5 μl AcTEV。混匀后，将溶液分至两个1.5 ml Eppendorf管中，以利于充分混合。在4°C冷藏室中于旋转平台上过夜孵育。
- 离心沉淀磁珠，将洗脱液转移至新的1.5 ml离心管中。用额外的0.5 ml TEV-C缓冲液洗涤磁珠。
- 将洗脱液合并至一个离心管中，总体积应为1.5 ml。**保留一份TEV洗脱液的等分试样**
三氯乙酸（TCA）沉淀（对于基于质谱的分析，我们建议使用乙醇/乙酸盐沉淀）
- 用100%三氯乙酸（TCA）将等分试样调节至25% TCA。具体操作为：将1.5 ml洗脱液分装至两个离心管中，每管750 μl，然后向每管中加入250 μl 100% TCA。溶液应变为乳白色。
- 置于冰上30分钟，期间定期涡旋振荡。
- 在4°C离心机中以最大速度离心30分钟。
- 用含有0.05 N HCl的500 μl冰丙酮洗涤一次，在4°C下以最大速度离心5分钟。
- 用500 μl预冷的丙酮洗涤一次，在4°C下以最大转速离心5分钟。
- 小心移除丙酮并干燥沉淀。
- 银染时，将沉淀重悬于50 μl 1×SDS上样缓冲液中。
乙醇/乙酸盐沉淀
- 加入 20 µg 甘油三酯
- 将样品用100%乙醇稀释5倍，并调节至50 mM NaCH3COO，2.5 M 储液，pH 5.0
- 将溶液静置2小时
- 室温下以12,000 × g离心10分钟，沉淀蛋白质。
NP-40 缓冲液（配制 200 ml）
| 储存液浓度 | 添加量 | |
| 10 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.2) | 0.1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0.1 mM Na3VO4 | 10 mM | 2 ml |
| 加水至 200 ml | ||
使用前添加：
- 1 M DTT 的 1/1,000
- 蛋白酶抑制剂混合物（Protease Inhibitors Cocktail）的 1/2,000
TEV-C 缓冲液（配制 50 ml）
| 储存液浓度 | 添加量 | |
| 25 mM Tris (pH 8.0) | 100 mM | 12.5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3.75 ml |
| 0.1 % NP-40 | 100 % | 50 _l |
| 0.5 mM EDTA | 500 mM | 50 __l |
| 加水至 50 ml | ||
使用前添加：
- 1/1,000 的 1M DTT
- 1/2,000 的 PIC
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讨论
纯化过程中保存的等分试样应包括：(1) 预清除的细胞裂解液，(2) 结合组分，(3) 未结合组分，以及 (4) 洗脱组分。我们建议通过抗-TAP 抗体的 Western 印迹或银染法分析上述各等分试样的蛋白质含量，以反映实验的结合与洗脱效率。图1展示了银染凝胶和印迹结果的示例。
由于SILAC能够提供无偏倚且可定量的蛋白质结合伴侣检测结果，我们仅进行TAP纯化的第一阶段，以尽量减少样品损失。如果你遇到明显的非特异性结合，可考虑执行完整的实验流程，具体步骤详见《冷泉港实验手册》（4）。
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参考文献
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.
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重印与许可
