测量由酸性pH和α-扩张蛋白诱导的植物细胞壁伸展（蠕变）

摘要

我们展示了如何使用恒力伸长仪来测量由酸性缓冲液和膨胀蛋白诱导的植物细胞壁样品的长期伸长（蠕变）。

摘要

植物细胞壁在生长过程中表现出一种称为“酸性生长”的特性，即在低pH（< 5）条件下其延展性更强¹。植物激素生长素至少部分通过酸性生长机制，快速促进幼茎及其他类似组织的细胞伸长^2,3。生长素可激活质膜上的H⁺泵，导致细胞壁溶液酸化。细胞壁酸化进而激活扩张蛋白（expansins），这类内源性蛋白质可松弛细胞壁结构⁴，使细胞壁顺应由细胞膨压所产生的张力而发生松弛。结果，细胞开始迅速增大。这种“酸性生长”现象可在分离的（无生命）细胞壁样品中方便地测定。细胞壁发生酸诱导延伸的能力并不仅仅取决于细胞壁多糖（如果胶）的结构排列，而是依赖于扩张蛋白的活性⁵。扩张蛋白目前尚未发现具有任何已知的酶活性，因此检测其活性的唯一方法就是测定其诱导细胞壁延伸的能力。本视频报告详细介绍了用于扩张蛋白活性检测的适宜细胞壁材料的来源及制备技术，并进一步展示了由酸诱导及扩张蛋白诱导的、来自生长中黄瓜下胚轴的细胞壁样品的延伸过程。

为了获得合适的细胞壁样品，将黄瓜幼苗在黑暗中培养，切下下胚轴并置于 -80 °C 冷冻。冷冻的下胚轴经研磨、压平后，固定在特制的比色皿中，并在恒定张力下进行伸长仪测量。为了测定酸诱导的伸长，细胞壁最初被置于中性 pH 缓冲液中，此时细胞壁中天然存在的扩张蛋白（expansins）活性较低。当缓冲液更换为酸性 pH 后，扩张蛋白被激活，细胞壁迅速伸长。我们还通过重建实验验证了扩张蛋白的活性。在此部分实验中，我们采用短暂加热处理使细胞壁样品中的天然扩张蛋白变性失活。这些失活的细胞壁即使在酸性缓冲液中也不发生伸长，但向其中添加扩张蛋白后，细胞壁的伸长能力迅速恢复。

方案

第1部分：培养与保存合适的植物材料

1. 根据我们的经验，黄化黄瓜幼苗的下胚轴是进行这些实验的细胞壁材料的便捷来源。将黄瓜种子播种在湿润的滤纸上，放入避光盒中，并置于恒温为26 °C的暗室中培养。精确的温度并非关键，22 °C至30 °C之间的任何温度均可，但温度会影响幼苗达到合适发育阶段的速度：温度越高，幼苗发育越快。我们通常在幼苗长至约5 cm长时使用，这通常在播种后3–4天达到。幼苗必须在黑暗条件下生长，因为即使少量光照也会影响幼苗的发育速率以及我们利用该技术所测定的细胞壁特性。在第3天，可使用微弱的绿色滤光灯短暂打开盒子，观察幼苗的生长情况。
2. 将幼苗快速切割后装入小型塑料盒中，每盒100–150株，并在-80 °C下保存。在此温度下，样品可保持数周的有效性。

第二部分：制备细胞壁样品

1. 将8-10株冷冻的切段幼苗从冰箱转移至装有-80℃冷冻块的保温容器中。
2. 用碳化硅磨擦下胚轴表面的角质层。操作时，将湿润的碳化硅粉末调成浓浆，均匀涂于拇指和食指之间，然后反复夹拉下胚轴。施加压力的力度需有一定经验：压力过大，表皮层会被撕裂；压力过小，则无法使角质层通透。此外，操作需迅速，因为冷冻的下胚轴在解冻后会变得软塌，难以处理。
3. 将磨擦后的下胚轴浸入冰水中，以去除大部分附着的碳化硅，随后置于冰水中保存，同时以相同方法处理其余下胚轴。
4. 使用新的单刃剃刀将下胚轴切割至所需长度（通常为1.2 cm），然后整齐排列在载玻片上。
5. 接下来需压平细胞壁，以去除细胞液并便于后续夹持。将另一张载玻片盖在8-10个样品上，形成“三明治”结构，并在上方放置400-500 g的重物，持续5分钟。通常我们使用装有适量水的烧杯作为重物。
6. 可选步骤：根据实验需要，此时可对下胚轴进行短暂加热处理以使其失活。具体操作为：用一对橡皮筋将两张载玻片绑紧，将组装好的样品放入盛有100 mL去离子水（室温）的容器中，再置于微波炉内全功率加热。在我们的微波炉中，水约50秒开始沸腾，沸腾后继续加热15秒即停止。随后迅速倒掉热水，换入冷水以终止变性反应。由于不同微波炉性能存在差异，您可能需要调整加热时间。过度加热会导致样品变弱、易断裂；加热不足则内源扩张蛋白未完全失活，细胞壁样品仍对酸性pH有一定响应性。

第3部分：引伸计设置

1. 现在将细胞壁样品夹持在恒力伸长仪中。这是一种定制装置，由一个用于固定样品基端的有机玻璃比色皿和一个连接在样品顶端的可移动夹具组成。可移动夹具安装在一根穿过位置传感器（LVDT，即“线性可变差动变压器”）开放线圈的杆末端，该传感器通过电子方式检测连接在杆上的小型金属圆柱体（即“铁芯”）的位置。杆的上端连接到一个带有可调平衡重的杠杆，该杠杆对细胞壁样品施加可调节的向上拉力。通过在杠杆远端增加或移除已校准的金属砝码来调节施加的力。
2. 回到细胞壁样品的操作——用精细镊子夹起下胚轴样品的基端，并将顶端约 2–3 mm 置于可移动夹具的开口钳口之间。该夹具是一种弹簧加载的鳄鱼夹，其金属钳口涂有塑料层，以防止金属表面与缓冲液或细胞壁样品直接接触。根据我们的经验，金属离子可能从夹具中渗出，从而抑制细胞壁的延伸能力，因此我们始终保持金属部分被覆盖。
3. 一手握住可移动夹具组件，将细胞壁样品的基端小心地插入有机玻璃比色皿的两个铰接部件之间，然后合拢比色皿并拧紧螺丝，从而将样品底端牢固固定在比色皿中。
4. 随后缓慢释放可移动夹具组件，使平衡重的全部拉力传递至细胞壁样品。我们通常对黄瓜下胚轴制备的细胞壁样品使用总重为 20 g 的平衡重。其他类型的细胞壁材料或实验可能需要不同的重量。
5. 向比色皿中加入缓冲液（200 µL），并通过调节螺丝上下移动比色皿的位置，使可移动夹具位于LVDT测量范围的下端。我们的LVDT连接至微型计算机的数据采集单元，因此可通过计算机实时监测LVDT的位置。共有八个LVDT组件并联连接至同一台计算机，使我们能够同时运行八个细胞壁样品。计算机每 30 秒记录一次每个LVDT组件的位置。

第4部分：酸性pH或膨胀素诱导的伸长效应测定——代表性结果

1. [第一个实验] 为了测量酸诱导的伸展，我们从天然的细胞壁样品（即未经加热灭活的样品）开始，并向比色皿中加入中性缓冲液。细胞壁样品在施加张力后会伸展几分钟，但数分钟后伸展速率逐渐衰减至较低水平。我们的计算机系统可监测样品长度的变化（即实验开始后可移动夹具位置的变化），也可监测位置对时间的导数，即伸展速率。随着时间推移，伸展速率逐渐稳定在较低值。
2. 约20分钟后，移除中性缓冲液。我们使用一根由粗规格皮下注射针头制成的细金属管，连接真空泵，以快速移除缓冲液，同时尽量减少对细胞壁或机械装置的扰动。随后加入酸性缓冲液，有时进行1-2次快速置换，以确保完全替换为酸性缓冲液。然后我们静观细胞壁的反应。通常在几分钟内即可检测到伸展速率加快。60分钟后，我们通常已获得足够的信息来评估伸展反应，尽管在某些情况下测量可能持续更长时间。
3. [第二个实验] 为了测量扩张蛋白诱导的细胞壁伸展，我们从经加热灭活的细胞壁样品开始，并向比色皿中加入酸性缓冲液。与第一个实验相同，由于缺乏有功能的扩张蛋白，细胞壁伸展速率逐渐稳定在较低水平。
4. 约20分钟后，通过向比色皿中的缓冲液“添加”10–20 µL扩张蛋白溶液，将扩张蛋白加入体系。扩张蛋白迅速渗透进入细胞壁样品，数分钟内即可观察到伸展速率上升。该伸展反应可持续监测一小时或更长时间。

图1： 制备细胞壁以评估酸诱导或膨胀蛋白诱导的细胞壁伸长的实验流程示意图。

讨论

在本实验演示中，我们使用了黄瓜下胚轴的细胞壁，因为它们已被证明是可靠且易于操作的细胞壁样品来源，并具有良好的响应灵敏度。我们还成功地使用了其他幼苗的细胞壁，以及一些来自超市的材料，例如嫩菠菜叶和芹菜茎。基本上，年轻、柔软、快速生长的植物组织适合用该技术进行测量；而坚韧、老化、氧化或不再生长的植物组织由于细胞壁存在交联，通常难以产生响应。此外，还需注意以下几点：

1. 生物变异性——即使使用均一的幼苗，其反应也可能存在差异，因此至少需要设置5-8个重复，才能获得具有统计学意义的结果。
2. 角质层的机械擦伤对于缓冲液和蛋白质快速渗透进入细胞壁样品至关重要。若角质层未充分擦伤，样品对酸性缓冲液的反应将变得缓慢且微弱，蛋白质甚至可能无法穿透角质层以引发反应。某些样品可能无需擦伤处理，例如使用表皮剥离物或其他分离组织时。对于许多初学者而言，擦伤不均匀会引入显著的实验变异性。
3. 热失活可用于去除或变性内源性扩张蛋白，也可采用其他方法实现，但需确定使内源性扩张蛋白失活所需的最低加热程度，以避免细胞壁样品过度弱化或断裂。
4. 扩张蛋白易因氧化而失活，因此在缓冲液中添加1-5 mM二硫苏糖...