测量由酸性pH和α-扩张蛋白诱导的植物细胞壁伸展（蠕变）

摘要

我们展示了如何使用恒力伸长仪来测量由酸性缓冲液和膨胀蛋白诱导的植物细胞壁样品的长期伸长（蠕变）。

摘要

植物细胞壁在生长过程中表现出一种称为“酸性生长”的特性，即在低pH（< 5）条件下其延展性更强¹。植物激素生长素至少部分通过酸性生长机制，快速促进幼茎及其他类似组织的细胞伸长^2,3。生长素可激活质膜上的H⁺泵，导致细胞壁溶液酸化。细胞壁酸化进而激活扩张蛋白（expansins），这类内源性蛋白质可松弛细胞壁结构⁴，使细胞壁顺应由细胞膨压所产生的张力而发生松弛。结果，细胞开始迅速增大。这种“酸性生长”现象可在分离的（无生命）细胞壁样品中方便地测定。细胞壁发生酸诱导延伸的能力并不仅仅取决于细胞壁多糖（如果胶）的结构排列，而是依赖于扩张蛋白的活性⁵。扩张蛋白目前尚未发现具有任何已知的酶活性，因此检测其活性的唯一方法就是测定其诱导细胞壁延伸的能力。本视频报告详细介绍了用于扩张蛋白活性检测的适宜细胞壁材料的来源及制备技术，并进一步展示了由酸诱导及扩张蛋白诱导的、来自生长中黄瓜下胚轴的细胞壁样品的延伸过程。

为了获得合适的细胞壁样品，将黄瓜幼苗在黑暗中培养，切下下胚轴并置于 -80 °C 冷冻。冷冻的下胚轴经研磨、压平后，固定在特制的比色皿中，并在恒定张力下进行伸长仪测量。为了测定酸诱导的伸长，细胞壁最初被置于中性 pH 缓冲液中，此时细胞壁中天然存在的扩张蛋白（expansins）活性较低。当缓冲液更换为酸性 pH 后，扩张蛋白被激活，细胞壁迅速伸长。我们还通过重建实验验证了扩张蛋白的活性。在此部分实验中，我们采用短暂加热处理使细胞壁样品中的天然扩张蛋白变性失活。这些失活的细胞壁即使在酸性缓冲液中也不发生伸长，但向其中添加扩张蛋白后，细胞壁的伸长能力迅速恢复。

方案

第1部分：培养与保存合适的植物材料

1. 根据我们的经验，黄化黄瓜幼苗的下胚轴是进行这些实验的细胞壁材料的便捷来源。将黄瓜种子播种在湿润的滤纸上，放入避光盒中，并置于恒温为26 °C的暗室中培养。精确的温度并非关键，22 °C至30 °C之间的任何温度均可，但温度会影响幼苗达到合适发育阶段的速度：温度越高，幼苗发育越快。我们通常在幼苗长至约5 cm长时使用，这通常在播种后3–4天达到。幼苗必须在黑暗条件下生长，因为即使少量光照也会影响幼苗的发育速率以及我们利用该技术所测定的细胞壁特性。在第3天，可使用微弱的绿色滤光灯短暂打开盒子，观察幼苗的生长情况。
2. 将幼苗快速切割后装入小型塑料盒中，每盒100–150株，并在-80 °C下保存。在此温度下，样品可保持数周的有效性。

第二部分：制备细胞壁样品

1. 将8-10株冷冻的切段幼苗从冰箱转移至装有-80℃冷冻块的保温容器中。
2. 用碳化硅磨擦下胚轴表面的角质层。操作时，将湿润的碳化硅粉末调成浓浆，均匀涂于拇指和食指之间，然后反复夹拉下胚轴。施加压力的力度需有一定经验：压力过大，表皮层会被撕裂；压力过小，则无法使角质层通透。此外，操作需迅速，因为冷冻的下胚轴在解冻后会变得软塌，难以处理。
3. 将磨擦后的下胚轴浸入冰水中，以去除大部分附着的碳化硅，随后置于冰水中保存，同时以相同方法处理其余下胚轴。
4. 使用新的单刃剃刀将下胚轴切割至....

讨论

在本实验演示中，我们使用了黄瓜下胚轴的细胞壁，因为它们已被证明是可靠且易于操作的细胞壁样品来源，并具有良好的响应灵敏度。我们还成功地使用了其他幼苗的细胞壁，以及一些来自超市的材料，例如嫩菠菜叶和芹菜茎。基本上，年轻、柔软、快速生长的植物组织适合用该技术进行测量；而坚韧、老化、氧化或不再生长的植物组织由于细胞壁存在交联，通常难以产生响应。此外，还需注意以下几点：

1. 生物变异性——即使使用均一的幼苗，其反应也可能存在差异，因此至少需要设置5-8个重复，才能获得具有统计学意义的结果。
2. 角质层的机械擦伤对于缓冲液和蛋白质快速渗透进入细胞壁样品至关重要。若角质层未充分擦伤，样品对酸性缓冲液的反应将变得缓慢且微弱，蛋白质甚至可能无法穿透角质层以引发反应。某些样品可能无需擦伤处理，例如使用表皮剥离物或其他分离组织时。对于许多初学者而言，擦伤不均匀会引入显著的实验变异性。
3. 热失活可用于去除或变性内源性扩张蛋白，也可采用其他方法实现，但需确定使内源性扩张蛋白失活所需的最低加热程度，以避免细胞壁样品过度弱化或断裂。
4. 扩张蛋白易因氧化而失活，因此在缓冲液中添加1-5 mM二硫苏糖.......