衣藻（Chlamydomonas reinhardtii） 的交配与四分孢子分离用于遗传学分析

摘要

在Chlamydomonas reinhardtii中进行遗传学分析需要完成交配和四分孢子分离。本文展示了配子形成、交配、合子萌发及四分体解剖的标准方法。本实验方案包含一系列易于操作的步骤，可使对Chlamydomonas不够熟悉的科研人员也能顺利开展遗传学研究。

摘要

单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtii(Chlamydomonas) 已成为细胞生物学和遗传学多个研究领域的常用模式生物，因其具有简单的生活周期、易于培养和进行遗传分析操作、丰富的基因组资源，以及细胞核和两种细胞器均具有可转化性。在采用遗传学方法研究时，通常需要进行交配型菌株的杂交Chlamydomonas，以创建营养二倍体用于显性分析，或在四分体分离后用于确定核基因与细胞器基因的遗传方式、检测等位性、分析上位性，或为基于图谱的克隆构建群体。此外，遗传杂交也常规用于将特定的细胞器基因型与特定的核基因型进行组合。本文中，我们展示了配子形成、交配、合子萌发及四分体分离的标准方法。本实验方案包含一系列易于操作的步骤，可使遗传学方法更易于被对该领域较为陌生的研究人员掌握Chlamydomonas. 重点参数和常见问题环节将进行详细说明。最后，将提供进一步信息的资源以及替代方法的相关内容。

方案

第1部分：配子发生用菌株的制备

注意：所有操作均应在室温下进行。温度过高或过低都会影响合子萌发速度，并可能对存活率产生不利影响。
重要提示：用于交配的菌株必须处于旺盛生长期，且无真菌或细菌污染。若菌株未定期传代，在制备配子前应先在丰富培养基上进行传代培养。

1. 将待交配的菌株转移至TAP平板（100×15 mm）上，每板1-2个菌株。细胞应以约1 cm宽的浓密条带形式生长。
2. 在TAP平板上继续培养，直至形成一层生长旺盛的厚实细胞层，必要时可进行中间传代。近期未传代的菌株可能需要传代一次，总共约1周时间；而常规使用的野生型菌株可能仅需数天且无需传代。对光敏感的突变株可能需要更长时间。
3. 将TAP平板上的所有细胞转移至缺乏氮的N10平板，以启动配子形成。转移时应保持细胞呈厚实块状，如同其在TAP平板上的状态，以便后续收集细胞。在N10平板上培养3天后，细胞即具备进行配子形成的条件。在N10平板上细胞分裂较慢，但细胞应保持深绿色。任何被污染的菌株均应丢弃，因其无法获得有活力的合子。

第二部分：交配

1. 将每种菌株转移至一个 50 ml 的三角烧瓶中，并加入约 2.5 ml 无菌蒸馏水重悬。可使用接种环或无菌玻璃棒进行操作；关键在于细胞应充分悬浮，避免形成团块。应调整加水量，使各菌株的细胞浓度（通过肉眼观察）大致相同。
2. 在强光（1.260 μE/m²/sec）下振荡培养细胞 2 小时，期间细胞将转变为具有运动能力的配子。应在光学显微镜下检查细胞运动性。若配子游动能力差，则交配效率可能较低。然而，即使运动性较差的菌株仍可进行交配，只是频率降低。
3. 随后，将等体积的 mt+ 和 mt− 配子混合至同一个 50 ml 烧瓶中。将配子混合物置于强光（1.260 μE/m²/sec）下静置培养，不进行振荡。
4. 可在光学显微镜下立即检查交配情况。配子成对结合的过程迅速，表现为两条鞭毛端相连并快速移动的细胞。若观察到交配过程极为迅速，应在 30 分钟至 1 小时内取样以获取合子。若非如此，可每隔 1 小时检查一次，但此步骤为可选。由于不同杂交组合产生合子的最佳密度时间差异较大，建议在配子混合后的不同时间点（例如 1、2、3 和 4 小时）分别取样。取样方法为：将 300 µL 样品点于 TAP-3% Difco 琼脂 60×15 mm 培养皿上，每皿点 3–4 个点。注意在取样过程中避免振荡交配混合物，以免破坏已形成的交配对。使用 Difco 琼脂是因为其杂质少于低价琼脂，便于在显微镜下清晰观察合子。
   未使用的交配混合物可于烧瓶中过夜放置，次日即可明显判断交配反应的质量。当交配效率高时，合子会附着在烧瓶壁或底部，培养基变得澄清，即使振荡烧瓶也无法使合子脱落。若在适度振荡后混合物中无任何物质附着于玻璃表面，则表明交配效率低下或未发生交配。
5. 含有交配混合物的 TAP-Difco 培养皿在无菌操作台中打开皿盖晾干，直至表面液体完全吸收。通常将培养皿置于光照下（700 nE/m²/sec）18 小时，随后用铝箔包裹，因为接合孢子的成熟仅在黑暗条件下进行。在培养皿及铝箔上均需标注杂交菌株、交配时间与日期。培养皿保存 5 至 7 天，也可更长时间，但合子萌发效率会随时间逐渐下降。

第3部分：四分体解剖

1. 应使用钝刀片（如解剖刀）从交配混合物的干燥斑块上刮取营养细胞。可用刀片暴露一团合子，这些合子会紧密地黏附在3%琼脂上。此步骤通常在下午进行，以便合子在次日早晨萌发，但尚未经历第二次营养分裂（否则会产生8个子代）。Chlamydomonas 研究人员会很快学会在显微镜下识别合子，因为它们比营养细胞更大，且具有较厚的合子孢子壁，呈现出黑色轮廓。合子孢子常呈黄色，但也可能略带绿色。最关键的特征是它们能黏附于琼脂表面，而营养细胞则容易被移开。然而，若平板过于干燥，则情况并非如此。此外，若交配混合物过于浓稠，合子可能形成团块，导致单个合子难以或无法转移。合适的密度应在步骤2.1中建立，并通过经验迅速掌握。
2. 准备玻璃针以收集合子并分离四分体子代。通过在小火焰中拉伸3 mm玻璃棒，制成细长的丝状结构，然后将其折断使用。将这些锥形末端的尖端在低温火焰（例如酒精灯或燃烧的火柴）中短暂加热，使其尖端变圆滑或弯成钩状。准备3根或更多的玻璃针，因为它们较易断裂，尤其对初学者而言。
3. 使用玻璃针在3% TAP-Difco平板上将合子收集成一小堆。用钝头解剖刀切下含有合子的一小块琼脂（面积不超过0.5 cm²），形成琼脂块。然后将该琼脂块正面朝下放置于15 mm的1.5% TAP-Difco平板上，并沿距平板顶部约1.5 cm的一条水平线滑动，以分散合子。在平板背面预先刻有一条顶部水平线，以及一个水平间距约1.5 cm、垂直间距约0.5 cm的网格。该网格将在第二天用于指导四分体子代的分离（也可在解剖当天刻制网格）。最后，将单个合子移至顶部水平线与每条垂直线的交点处，每块平板放置约20–30个合子。尽管通常仅解剖约12个合子，但并非所有合子都能萌发，且部分合子在破裂前可能发生两次分裂，因此需要额外的合子作为备用。
4. 在分散合子后，将倒置的平板置于盛有薄层氯仿（1–2 mm）的玻璃皿上方30秒，以杀死意外从3%琼脂平板转移的营养细胞。平板与氯仿之间的距离应约为5 cm。若氯仿用量过多，或距离过小或过大，可能导致合子死亡，或未能有效杀死营养细胞。氯仿处理必须在合子孢子被分布到萌发平板后立即进行，以确保选择性。
5. 大多数品系的萌发时间为16–20小时，但会因基因型及合子年龄而异。萌发期间，将平板置于弱光条件下 (239 nE/m²/sec)，或用纸巾覆盖平板以减弱中等光照。
6. 在显微镜下可识别已萌发的合子，表现为膨大或有时破裂的细胞，其内部含有子细胞。若合子孢子尚未破裂，可用玻璃针轻轻触碰，若已萌发则可刺破其壁。将子细胞轻轻拖拽至合子下方的网格交点处。最简便的方法是利用玻璃针施加压力从琼脂中释放少量液体培养基，将细胞包裹其中形成“小水洼”，并随玻璃针拖动。一种判断是否成功解剖的是合子而非已分裂两次的营养细胞的“保险”方法是：除四个子细胞外，合子孢子壁的“外皮”仍会残留。
7. 将分离后的子代在适宜条件下培养，直至形成可见菌落，以便后续挑取进行分析。应每天监测平板是否污染。

注意：本文未涉及营养二倍体的制备，该过程通常包括将交配混合物涂布于一种不能支持任一亲本菌株生长但可支持二倍体生长的培养基上（例如含有两种不同的营养缺陷型标记）。培养皿需置于光照条件下，以避免合子形成。

讨论

在Chlamydomonas中进行遗传分析较为简便，但需要特定的技术来诱导配子形成并分离四分体后代。对于生长状态良好的菌株，这些技术容易掌握；而对于某些突变菌株，则更依赖经验性的操作，读者可参考最新出版的《Chlamydomonas Sourcebook》第一卷，以获取相关的历史背景和实用建议。此外，需注意上述基本方法存在多种变体，包括诱导配子形成的手段、合子分布与解剖方式等。最终，每位研究人员都会找到适合自己的操作方式，或根据所在实验室的特定方案进行调整。

上述提到的某些技术细节需要再次强调。特别是，细胞必须保持健康且无任何污染。众所周知，长期未进行杂交的实验室适应性菌株可能交配效果不佳，水质也可能影响配子发生。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CC-125	交配型 plus 菌株	衣藻保种中心
CC-124	交配型 minus 菌株	衣藻保种中心
Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）	生长培养基
N10	生长培养基
Difco 琼脂	试剂
Fisherbrand 不锈钢刀片	工具	Fisher Scientific	08-916-5B
BD 外科刀柄	工具	Fisher Scientific	08-914-5
Fisherbrand 金属解剖刀	工具	Fisher Scientific	08-920A