衣藻（Chlamydomonas reinhardtii） 的交配与四分孢子分离用于遗传学分析

摘要

在Chlamydomonas reinhardtii中进行遗传学分析需要完成交配和四分孢子分离。本文展示了配子形成、交配、合子萌发及四分体解剖的标准方法。本实验方案包含一系列易于操作的步骤，可使对Chlamydomonas不够熟悉的科研人员也能顺利开展遗传学研究。

摘要

单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtii(Chlamydomonas) 已成为细胞生物学和遗传学多个研究领域的常用模式生物，因其具有简单的生活周期、易于培养和进行遗传分析操作、丰富的基因组资源，以及细胞核和两种细胞器均具有可转化性。在采用遗传学方法研究时，通常需要进行交配型菌株的杂交Chlamydomonas，以创建营养二倍体用于显性分析，或在四分体分离后用于确定核基因与细胞器基因的遗传方式、检测等位性、分析上位性，或为基于图谱的克隆构建群体。此外，遗传杂交也常规用于将特定的细胞器基因型与特定的核基因型进行组合。本文中，我们展示了配子形成、交配、合子萌发及四分体分离的标准方法。本实验方案包含一系列易于操作的步骤，可使遗传学方法更易于被对该领域较为陌生的研究人员掌握Chlamydomonas. 重点参数和常见问题环节将进行详细说明。最后，将提供进一步信息的资源以及替代方法的相关内容。

方案

第1部分：配子发生用菌株的制备

注意：所有操作均应在室温下进行。温度过高或过低都会影响合子萌发速度，并可能对存活率产生不利影响。
重要提示：用于交配的菌株必须处于旺盛生长期，且无真菌或细菌污染。若菌株未定期传代，在制备配子前应先在丰富培养基上进行传代培养。

1. 将待交配的菌株转移至TAP平板（100×15 mm）上，每板1-2个菌株。细胞应以约1 cm宽的浓密条带形式生长。
2. 在TAP平板上继续培养，直至形成一层生长旺盛的厚实细胞层，必要时可进行中间传代。近期未传代的菌株可能需要传代一次，总共约1周时间；而常规使用的野生型菌株可能仅需数天且无需传代。对光敏感的突变株可能需要更长时间。
3. 将TAP平板上的所有细胞转移至缺乏氮的N10平板，以启动配子形成。转移时应保持细胞呈厚实块状，如同其在TAP平板上的状态，以便后续收集细胞。在N10平板上培养3天后，细胞即具备进行配子形成的条件。在N10平板上细胞分裂较慢，但细胞应保持深绿色。任何被污染的菌株均应丢弃，因其无法获得有活力的合子。

第二部分：交配

1. 将每种菌株转移至一个 50 ml 的三角烧瓶中，并加入约 2.5 ml 无菌蒸馏水重悬。可使用接种环或无菌玻璃棒进行操作；关键在于细胞应充分悬浮，避免形成团块。应调整加水量，使各菌株的细胞浓度（通过肉眼观察）大致相同。

讨论

在Chlamydomonas中进行遗传分析较为简便，但需要特定的技术来诱导配子形成并分离四分体后代。对于生长状态良好的菌株，这些技术容易掌握；而对于某些突变菌株，则更依赖经验性的操作，读者可参考最新出版的《Chlamydomonas Sourcebook》第一卷，以获取相关的历史背景和实用建议。此外，需注意上述基本方法存在多种变体，包括诱导配子形成的手段、合子分布与解剖方式等。最终，每位研究人员都会找到适合自己的操作方式，或根据所在实验室的特定方案进行调整。

上述提到的某些技术细节需要再次强调。特别是，细胞必须保持健康且无任何污染。众所周知，长期未进行杂交的实验室适应性菌株可能交配效果不佳，水质也可能影响配子发生。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CC-125	交配型 plus 菌株	衣藻保种中心
CC-124	交配型 minus 菌株	衣藻保种中心
Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）	生长培养基
N10	生长培养基
Difco 琼脂	试剂
Fisherbrand 不锈钢刀片	工具	Fisher Scientific	08-916-5B
BD 外科刀柄	工具	Fisher Scientific	08-914-5
Fisherbrand 金属解剖刀	工具	Fisher Scientific	08-920A