通过将神经生理记录与高速视频技术相结合，可获得自由活动动物神经活动模式的非侵入性测量结果。
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本文内容
摘要
摘要
在无约束动物中，神经活动模式与相应行为表达之间的关系难以建立。传统的非侵入性方法至少需要对研究对象进行部分约束，并且仅能识别大量同时激活的神经元。另一方面，对于少量神经元群体或单个神经元的测量，只能通过在高度简化制备的样本上进行单细胞记录来实现。由于在被约束或解剖的动物中，自然行为的表达受到限制，因此控制此类行为的潜在神经机制难以被识别。
本文介绍了一种非侵入性的生理学技术，可用于测量自由活动动物中神经回路的激活状态。通过在充满水的腔室中使用一对导线电极，浴电极可记录螯虾幼体在自然或实验诱发的逃避反应过程中产生的神经和肌肉场电位。螯虾的主要逃避反应由三种不同类型的尾扇运动介导，这些运动使动物远离刺激点。每种尾扇运动均由其特定的神经回路控制；其中最快且最强有力的两种逃避反应需要激活不同群组的大尺寸“指令”神经元。结合行为观察，浴电极记录可明确识别这些神经元及其相关的神经回路。因此，可在无束缚的动物中，于不同行为背景下测量自然发生行为所依赖的神经回路活动。
方案
第一部分：记录室
- 记录室呈矩形，由薄壁玻璃制成。对于体长（从吻部至尾节测量）为 2.5 – 3.5 cm 的动物，记录室的尺寸为 8.5 cm × 2 cm × 5 cm（长 × 宽 × 高）。
参见图 1，了解本实验中所用记录室的示例。 - alternatively，记录室也可由其他材料（例如，无毒透明塑料）制成。记录室的尺寸可根据实验流程进行调整，应针对每一系列实验进行定制。为获得最佳效果，记录室的尺寸应在不限制动物自然行为的前提下尽可能小。作为经验法则，记录室的长度和宽度不应超过动物体长的三倍。
第二部分：浴电极与接地线
- 使用一对记录电极和一个接地电极。电极由绝缘铜线制成（26 AWG，绝缘层厚度0.25 mm）。浴槽电极的一端连接至细胞外放大器（A-M Systems 1700；见下文），另一端剥除0.5–1.0 mm的绝缘层。接地导线连接至放大器的接地端或其他任何接地设备，其另一端剥除2–3 cm的绝缘层。
- 将浴槽电极和接地导线用无毒胶水固定在记录室的内壁上。记录电极位于记录室两侧短边中央，彼此相对（图1）。
- 接地电极位于记录室一侧长边，与记录电极垂直（图1）。
- 向记录室中加入去离子水。使用高电阻水（约18 MΩ）可获得最佳效果。
第3部分：浴电极记录
- 记录电极的输出信号由细胞外放大器（A-M Systems；型号 1700）进行放大（1000 倍）。记录电极的信号通过低频（< 100 Hz）和高频截止（> 5 kHz）组合滤波。然后将信号连接至切换盒和数据采集板（National Instruments）。数字化数据使用数据采集软件（Photron Motion Tools）进行记录、存储和分析。
- 或者，记录电极的放大信号可使用其他模数转换器（例如 MDS Analytical Technologies；Digidata 1440）进行数字化，随后使用其他 commercially available 数据采集软件（例如 MDS Analytical Technologies；Axoscope）记录数字化数据。
第4部分：刺激探针
- 刺激探针由一根玻璃移液管（14 cm 长度）制成，管内装有一对细金属丝电极。电极尖端暴露长度为 0.2 mm，当探针接触动物时可产生电信号，从而精确测量刺激时间。
- 刺激探针的输出信号由细胞外放大器（A-M Systems；型号 1700）放大（1000 倍）。信号通过低频（< 100 Hz）和高频（> 5 kHz）滤波组合进行滤波处理，随后连接至一个切换盒和数据采集板（National Instruments）。数字化数据通过数据采集软件（Photron Motion Tools）进行记录、存储和分析。
第5部分：视频记录
- 将高速摄像机（Fastcam-X 1280 PCI, Photron）置于记录室的侧面，以获取侧视图像。记录室内亮度需调节至最佳水平，例如使用鹅颈式照明器或其他可聚焦光源。
- 高速摄像与电子记录通过接线盒和数据采集板（National Instruments）实现同步。浴槽电极的放大信号通过 BNC 电缆连接至接线盒和数据采集板。外部手动开关触发信号可启动同步的视频和数据采集。
第6部分：实验步骤
- 将一只动物放入实验腔室，使其适应5分钟。通过分别对头部或腹部施加不同强度的单次轻敲，诱发逃避性尾部翻转反应。轻敲强度由实验者控制。每次逃避性尾部翻转均以每秒1000帧的高速视频进行记录，同时以25 kHz的采样频率记录电场电位数据点。浴槽记录与视频记录的启动通过触发盒上的手动开关控制。记录时长由所选帧率决定（例如，1000 f/sec 对应总记录时间为4秒）。可分别设置触发前和触发后的记录时间。
- 注意：对于每一种被测试的物种，应通过将浴槽电极记录与其他可用的记录方法结合，验证浴槽电极记录的准确性。在螯虾中，可在外科手术下将一对银电极植入腹神经索周围。施加诱发逃避性尾部翻转的刺激后，可比较植入电极与浴槽电极所记录的电信号轨迹。
- 逃避性尾部翻转行为及其相应的神经活动可在多种不同情境下记录，例如对视觉威胁的反应、捕食者攻击期间，或两只螯虾之间的争斗性互动过程中。实验腔室大小、记录模式等参数需相应调整（参见讨论部分）。
第7部分：数据分析
- 使用运动分析软件（Photron）对单个视频帧进行分析。通过电子信号轨迹识别每次刺激所激活的神经回路类型。将视频数据与同步的生理记录进行比较，以确定动物的运动行为及被激活的神经回路。每种被激活的神经回路均会产生特征性的电子信号模式（参见代表性结果）。
- 通过测量探针信号起始时间与浴电极记录信号起始时间之间的延迟，计算每次实验中探针接触与神经/肌肉反应之间的潜伏期。
第8部分：代表性结果
一系列高速视频帧及其对应的电场记录，显示幼年小龙虾头部或尾部受到触觉刺激后产生的逃避尾抽反应（图2）。
图2A：头部施加的强触觉刺激引发由内侧巨神经元回路控制的尾部翻转反应。记录到的巨神经元放电（星号）以及随后出现的大幅时相性偏转，能够明确无误地识别该尾部翻转反应是由巨神经元活动介导的。视频轨迹中显示的向后运动可确定被激活的神经回路身份（MG）。
图2B：在对尾部施加强烈的触觉刺激后，由外侧巨神经元回路介导的尾部翻转反应。视频轨迹中观察到的向上和向前运动，结合同步的电子记录显示的巨电位尖峰以及大幅的、时相性的初始偏转，共同确定了被激活的神经回路的身份（LG）。
图 2C：由非巨型神经回路控制的尾部翻转。向动物胸部施加较为缓慢的触觉刺激。尽管视频中捕捉到的运动无法明确识别所激活的神经回路，但电子记录中未出现巨型峰电位，仅包含较小的偏转波形，表明激活的是非巨型回路（Non-G）。
图3：三种逃避尾部翻转反应的潜伏期测量。测量了七只动物从探针接触至产生生理反应的时间。由巨大神经元介导的尾部翻转反应显著快于非巨大神经元介导的尾部翻转反应。
图1： 本实验中用于体长为2.5-3.5 cm动物的记录室示例。浴槽电极被粘附在记录室相对的两侧，而接地线则连接在记录室的长边上，并与浴槽电极垂直。
图2： 在1000帧/秒下记录的单个视频帧，以及三种不同刺激类型的相应电子记录。
A) 对动物头部施加一个强烈的触觉刺激，引发了一次由内侧巨神经元（MG）介导的尾部翻转反应。左侧显示了六个视频帧。用于触碰动物的探针的记录迹线以灰色显示；接触点由黑色箭头指示。用浴电极记录的迹线以蓝色显示。插图显示了先导于大幅阶段性偏转之前的小型巨神经元动作电位。灰色条对应于左侧所示的视频帧。小龙虾尾部首次明显运动发生在第3帧，即探针接触后7毫秒。
B) 对动物尾部施加一个强烈的触觉刺激，引发了一次由外侧巨神经元（LG）介导的尾部翻转反应。左侧显示了六个视频帧。用于触碰动物的探针的记录迹线以灰色显示；接触点由黑色箭头指示。浴电极记录到的迹线以红色显示。插图显示了在大幅的时相性偏转之前出现的小型巨神经元动作电位。灰色条对应于左侧所示的视频帧。小龙虾尾部首次出现明显运动是在第3帧，即探针接触后8毫秒。
C) 对动物头部施加微弱且逐渐增强的触觉刺激，引发了一次由非巨细胞介导的尾部翻转反应。左侧显示了八个视频帧。用于触碰动物的探针记录轨迹以灰色显示；接触点由黑色箭头指示。通过浴电极获得的记录轨迹以黑色显示。该轨迹缺乏巨细胞动作电位，没有显著的初始大幅度偏转，而是由振幅小得多的电位组成。浅灰色条对应于左侧所示的视频帧。小龙虾尾部首次出现明显运动是在第6帧，即探针首次接触后115毫秒。
图3： 对七只不同性别但体型相似的动物（从吻部到尾节的平均长度 ± 标准差：3.2 cm ± 0.2 cm）测得的反应潜伏期。巨神经元介导的尾部翻转（MG，蓝色柱）和小神经元介导的尾部翻转（LG，红色柱）的反应潜伏期显著短于非巨神经元通路（Non-G，黑色柱）介导的尾部翻转。图中显示均值与标准差。标有相同字母的柱状图之间无显著差异（配对比较采用Wilcoxon符号秩检验，p < 0.05）。
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讨论
在无约束动物中，难以获得单个神经元活动或神经回路激活的非侵入性记录。本文所述方法提供了一种用于识别自然发生行为背后神经激活模式的手段。
过去，我们已成功运用该技术测量了幼年小龙虾在形成社会优势等级1、遭遇天敌攻击2以及近期对视觉威胁做出反应3时神经逃逸回路的活动模式。目前，我们采用同步浴电极记录与高速视频记录相结合的方法，以评估小龙虾执行逃逸行为过程中头部附肢运动的重要性。
尽管该技术目前仅在两种无脊椎动物（螯虾和蜻蜓）以及两个不同的实验室中应用过4，但它似乎有望推广至其他动物模型系统，包括一些具有由大型神经元控制行为的水生脊椎动物。例如，许多硬骨鱼类的快速逃逸反应由Mauthner细胞——一种可识别的大神经元——所控制5。由Mauthner细胞介导的逃逸行为在文献中已受到广泛关注，并已在多个分析层面上开展研究；然而，越来越多的证据表明，Mauthner细胞还控制着与逃逸无关情境下的快速躯体转向6,7
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
浴槽记录技术最初由 Fricke（1984）8 和 Beall 等人（1990）9 用于测量尾部翻转过程中产生的电场。该技术随后在乔治亚州立大学 Donald Edwards 博士的实验室中，由其前研究生 Fadi A. Issa 博士及其前博士后研究员 Jens Herberholz 博士进行了修改和完善。此后，马里兰大学 Jens Herberholz 博士的实验室对该技术进行了进一步优化，并测试了新的研究应用。我要感谢我的同事 David Yager 博士允许我使用他的高速视频系统，同时感谢我的研究助理 David Rotstein 和 William Liden 在实验中提供的帮助。
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参考文献
- Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish. J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).
- Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions. J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).
- Liden, W. H., Herberholz, J. Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J. Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).
- Finley, L. A., Macmillan, D. L. An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish. Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).
- Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish. Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).
- Canfield, J. G. Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated. J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).
- Wöhl, S., Schuster, S. The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start. J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).
- Fricke, R. A. Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses. Brain Res. 322, 139-143 (1984).
- Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture. J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).
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重印与许可
