大鼠脑组织聚集体培养物的制备用于神经元与胶质细胞发育研究

摘要

本文描述了一种胚胎大鼠脑组织聚集体培养体系的实验方案。聚集体中的多能前体细胞可发育并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

摘要

一种能够重现中枢神经系统（CNS）前体细胞发育并分化为成熟神经元和胶质细胞的体外系统，将为神经科学家研究轴突-胶质相互作用、多能前体细胞的特性与分化，以及少突胶质细胞谱系在细胞和分子水平的发育进程提供强有力的平台。本文介绍一种源自胚胎大鼠前脑的中枢神经系统聚集体培养系统，该系统可在无血清培养基中维持培养达3-4周，本实验室将其作为研究神经元-胶质细胞相互作用及中枢神经系统髓鞘形成的模型。本视频将演示如何从E16大鼠脑组织中分离并培养此类中枢神经系统聚集体。此外，通过同一脑组织解剖操作，还可便捷地获得高度富集的常规解离神经元培养物，用于中枢神经系统神经元的多种研究，或用于与其他细胞的共培养实验。

方案

解剖前的准备

手术器械：使用高压灭菌器对所有解剖剪刀和镊子进行灭菌

盖玻片清洗：

1. 将所有盖玻片（24孔板用直径15 mm）浸入1 L烧杯中的33% HCl中，至少浸泡24 h
2. 用流水冲洗10 min，期间偶尔晃动，以去除所有残留的HCl
3. 用Millipore水漂洗
4. 沥干水分
5. 将盖玻片浸泡于95–98%乙醇中
6. 将盖玻片转移至平皿中的洁净纸巾上，并使其自然晾干
7. 将盖玻片转移至玻璃烧杯中，用铝箔包裹后进行高压灭菌
   注意：此步骤后盖玻片可储存备用
8. 将单个盖玻片放入培养板中，准备进行包被

盖玻片包被：

1. 将聚-D-赖氨酸（PDL，10 mg/ml 溶于含 0.5% 牛血清白蛋白的 PBS 中，分装后于 -20°C 保存）的 100 倍浓缩液用 PBS 稀释，并经滤膜（0.22 μm）过滤除菌
2. 用 1 倍 PDL 溶液（约 0.15 ml/cm²）在 37°C 培养箱中孵育 2 小时，对盖玻片进行包被
3. 吸除 PDL 溶液，用无菌 ddH₂O 洗涤 3 次，并将盖玻片完全干燥

注意：为每次解剖准备足量的盖玻片/培养板。PDL包被的盖玻片可在4°C下保存数周。

培养基与溶液

解剖液（DM）：使用无菌冰上预冷的不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的汉克斯平衡盐溶液（HBSS，Invitrogen 14175），并添加 10 mM HEPES（Invitrogen 15630）。

聚集体培养基：DMEM/NBB27 培养基包含 DMEM/Neurobasal（1:1 体积比）、2% B27、1× Sato、0.5 mM 丙酮酸钠、0.75 mM GlutaMAX、60 μg/ml N-乙酰半胱氨酸、5 μg/ml 胰岛素、10 nM d-生物素以及 1% 青霉素/链霉素。配制 100 ml 聚集体培养基时，混合以下组分：50 ml DMEM（不含丙酮酸盐/谷氨酰胺，Invitrogen 11960）、50 ml Neurobasal 培养基（Invitrogen 211034）、375 μl GlutaMax（100×，Invitrogen 35050）、5.5 mg 丙酮酸钠（Sigma P2256）、2 ml B27（Invitrogen 17504）、6.3 mg N-乙酰半胱氨酸（Sigma A8199）、1 ml Sato 储存液（100× 储存液，见下文）、25 μl d-生物素储存液（4000× 储存液，PBS 中含 40 μM，分装后于 -20°C 保存，Sigma B4639）、100 μl 胰岛素（1000× 储存液，溶于 0.01 N HCl 中，浓度为 5 mg/ml，分装后于 -20°C 保存，Sigma 16634）、1 ml 青霉素/链霉素（100× 储存液，Invitrogen 15140），过滤除菌后于 4°C 保存。

Sato 100倍储存液： 配制40 ml储存液：将40 ml Neurobasal与400 mg apo-转铁蛋白（Sigma T2252）、400 mg BSA（Sigma A9647）、10 μl孕酮（25 mg/ml乙醇溶液，分装后于-20°C保存，Sigma P8783）、64 mg亚精胺（Sigma P7505）以及40 μl亚硒酸钠（30 μM PBS溶液，分装后于-20°C保存，Sigma S5261）混合。用滤器对Sato储存液进行除菌过滤，并分装后于-20°C保存。

神经元铺板培养基（PM）：Neurobasal 培养基、2% B27、2 mM 谷氨酰胺（100 倍储存液，分装后于 -20°C 保存，Invitrogen 25030）、25 μM 谷氨酸（100 倍储存液，分装后于 -20°C 保存）以及 1% 青霉素/链霉素。

神经元培养基（CM）：Neurobasal 培养基、2% B27、2 mM 谷氨酰胺（100倍浓缩液，分装后于 -20°C 保存）以及 1% 青霉素/链霉素。

5-FdU 储存液：100 倍浓度储存液，含 1 mM 5-氟-2'-脱氧尿苷（Sigma F0503）和 1 mM 尿苷（Sigma U3003）的 Neurobasal 培养基。经滤膜除菌后分装保存于 -20°C。

木瓜蛋白酶消化液（解剖前新鲜配制）：

1. 将 3.2 mg L-半胱氨酸（Sigma C-7352）溶解于 4 ml DM 中
2. 用 1N NaOH 调节 pH 至约 7.4（用 pH 试纸检测），并在 37°C 水浴中放置
   注意：在组织消化前立即进行下一步操作（见下文）。
3. 加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为 20 单位/ml
4. 过滤除菌（0.22 µm），并置于 37°C 水浴中

胰蛋白酶抑制剂溶液（解剖前新鲜配制）：

1. 将 0.2 g 胰蛋白酶抑制剂（Sigma T7295）溶于 20 ml DM 中
2. 检测 pH 值，并用 1 N NaOH 调节 pH 至约 7.4
3. 过滤除菌后，置于 37°C 水浴中

脑解剖

设置：

• 灭菌的镊子和剪刀
• 70% 乙醇
• 实验台上清洁的纸巾和尿垫
• 实验台上盛有冰冻 DM 的 10 cm 培养皿，用于子宫和胚胎
• 解剖显微镜下的冰平台
• 2–3 个盛有 DM 并置于冰上的 6 cm 培养皿
• 37°C 水浴中预热的 PM

1. 根据贵机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的程序，处死一只妊娠16天（E16）的Sprague-Dawley大鼠
2. 将大鼠仰卧于吸水垫上，并用酒精喷洒腹部区域进行消毒
3. 使用镊子提起腹部皮肤，用剪刀仅剪开皮肤，做V形切口
4. 分开皮肤，使用另一把无菌镊子和剪刀剪开肌层
5. 取出胚胎囊串链，转移至含有冰上预冷DM培养基的10 cm培养皿中
6. 使用显微解剖剪小心地从每个胚胎囊中分离出胚胎，再从每个胚胎中取出脑组织，并将游离的脑组织放入盛有DM培养基、置于冰上的洁净10 cm培养皿中
7. 在超净工作台内，借助解剖显微镜，切下中脑/后脑部分，用精细镊子去除脑膜，将清理后的皮层/海马组织转移至盛有DM培养基、置于冰袋上的新6 cm培养皿中
   注意： 此时组织已准备好进行酶消化。
8. 配制木瓜蛋白酶（papain）和胰蛋白酶抑制剂溶液，并过滤除菌
9. 吸除皮层/海马组织中多余的DM培养基
10. 加入4 ml已配制好的木瓜蛋白酶消化液
11. 将全部内容转移至50 ml离心管中，将Falcon管置于37°C水浴中，精确孵育5分钟
12. 用移液器吸除木瓜蛋白酶溶液
13. 加入5 ml胰蛋白酶抑制剂溶液，轻轻涡旋混匀，再置于37°C水浴中孵育2–3分钟
14. 吸除胰蛋白酶抑制剂溶液
15. 重复步骤13和14共三次
16. 加入20 ml预温的PM培养基
17. 反复吹打至所有团块消失（约20–30次）
18. 以100×g离心7分钟
19. 将沉淀重悬于10 ml PM培养基中，通过离心洗涤两次
20. 将沉淀重悬于10 ml PM培养基中用于常规神经元培养，或重悬于NBB27/DMEM培养基中用于聚集体培养
21. 将细胞悬液通过70 μm细胞筛
22. 计数活细胞
23. 按以下所述进行聚集体培养，或直接将细胞接种用于常规神经元培养
    注意： 在此步骤中，可通过将解离后的细胞以200–640个细胞/mm²的密度接种于多聚赖氨酸（PDL）包被的培养板上，获得高度富集的神经元培养物。待细胞贴壁后（约2–4小时），更换为预温的PM培养基。若需长期培养，在第4天更换一半培养基为预温的CM培养基。为获得高纯度神经元培养物，可在DIV2时加入有丝分裂抑制剂5-FdU（终浓度10 μM），以抑制非神经元细胞增殖（即作用于DIV2–3）。在CM培养基中恢复培养2天后，再次用5-FdU脉冲处理2天（DIV6–7），随后完全更换培养基。此后每3–4天更换一半新鲜预温的CM培养基。神经元可存活长达4周。

聚集体的制备与接种

1. 将解离的细胞悬浮于含有1× Sato、10 ng/ml CNTF和10 μM forskolin的NBB27/DMEM培养基中，细胞密度为2×10⁶ 个细胞/ml
2. 将2 ml细胞悬液转移至未包被的6孔板的每个孔中
3. 培养3个晚上。每天使用P1000移液器轻轻重悬细胞一次
   注意：细胞开始形成聚集体（图1）。
4. 在聚集体铺板前一天，用Matrigel包被培养板或盖玻片：
   • 将储存液Matrigel（生长因子减少型，BD Biosciences 354230）在冰上用冷DMEM按1:20稀释
     注意： Matrigel分装应按照制造商说明书操作。所有用于分装的枪头、Eppendorf管和溶液均需预冷，以避免Matrigel发生聚合。Matrigel分装后保存于-80°C，使用前在4°C解冻。
   • 将稀释后的Matrigel溶液每孔300 μl加入先前已用PDL包被的盖玻片上，于37°C培养箱中过夜包被
   • 用预热的PBS洗涤，再用预热的无菌ddH₂O洗涤培养板，并将培养板留在培养箱中。
5. 聚集体形成后第3天，再次轻轻重悬细胞，并通过200 μm滤网将悬液过滤至50 ml Falcon管中。静置约3–5分钟，使聚集体依靠重力自然沉降到管底
6. 小心移除上清液
7. 加入培养基，轻轻重悬聚集体后再次沉降。重复此步骤数次，以去除死细胞、单个细胞及碎片。使用显微镜检查上清液中是否仍含有未聚集成团的细胞或碎片
8. 将聚集体轻轻重悬于相同的NBB27/DMEM培养基中（图1），并计数聚集体数量
9. 调整聚集体密度至约25–30个聚集体/50 μl
10. 将聚集体悬液分装至2 ml Eppendorf管中（每管500–1000 μl），用于后续铺板
    注意： 由于聚集体容易沉降到管底，因此必须准备多个分装管。在将聚集体接种到包被的盖玻片或培养板前，应频繁轻轻重悬，以确保每个盖玻片上的聚集体数量相近。
11. 从培养箱中取出含有Matrigel包被盖玻片的培养板。吸除每孔中的液体，用预热的PBS和ddH₂O洗涤盖玻片，然后短暂干燥。此时盖玻片已准备好用于聚集体接种
12. 将含有聚集体悬液的管轻轻倒置，使聚集体分布均匀后再进行接种。向每张盖玻片中央加入50 μl聚集体悬液，轻柔地将培养板放回培养箱，避免扰动，以使聚集体均匀贴附于盖玻片上
    注意： 聚集体的密度至关重要。若聚集体之间距离过近或接种密度过高，随着生长它们容易相互融合。
13. 接种后4–6小时或次日清晨，向每孔中补充DMEM/NBB27培养基500 μl
14. 为维持聚集体培养，每3–4天更换一半培养基。换液时应小心操作，避免扰动聚集体，可通过沿孔壁缓慢加入新培养基的方式完成
    注意： 聚集体贴附至培养板数小时后，即可观察到从聚集体向外延伸的神经突。轴突在前两周内快速生长，并在不同聚集体之间形成丰富的连接（图2）。胶质前体细胞从聚集体呈放射状迁移，并随时间逐渐分化为星形胶质细胞和成熟的少突胶质细胞。

图1. 细胞在不同天数形成聚集体的相差显微图像，以及洗涤后的聚集体图像。

图2. 在Matrigel包被的盖玻片上接种后2天和12天的聚集体培养物的相差显微图像。

讨论

早期研究报道，在旋转介导的悬浮聚集体培养中可形成突触和成熟的髓鞘¹。本文所述的中枢神经系统（CNS）聚集体培养系统结合了多能前体细胞在三维聚集体中的无血清生长特性与传统二维培养的便利性，便于在体外分析细胞的发育、迁移和分化过程。in vitro。该系统可进行修改，用于神经前体细胞研究以及神经元-胶质细胞相互作用的探讨。例如，可将遗传修饰的细胞（如少突胶质细胞前体细胞）²加入聚集体培养中。也可研究小胶质细胞和巨噬细胞等免疫细胞或各种试剂对神经元和胶质细胞发育与分化的影响。最近，纯化的视网膜神经节细胞再聚集体已被用于在不含其他细胞的条件下与少突胶质细胞共培养，以研究中枢神经系统的髓鞘形成³。与先前报道一致⁴，Matrigel在促进细胞黏附、加速 neurite（神经突）生长及胶质细胞分化方面优于多聚赖氨酸（PDL）。因此，本实验方案中采用Matrigel作为细胞聚集体的基质。