使用全内反射荧光显微镜成像视网膜双极细胞中的胞吐作用

摘要

在本视频中，我们演示如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜对金鱼视网膜双极细胞中单个突触小泡的胞吐及转运过程进行标记与可视化观察。

摘要

全内反射荧光（TIRF）显微镜技术通过选择性成像靠近高折射率物质（如玻璃）的荧光分子，实现对细胞膜上发生的事件进行研究¹. 在本文中，我们将该技术应用于成像从金鱼视网膜分离的视网膜双极细胞中突触小泡的胞吐作用。由于这些神经元具有较大的轴突终末，非常适合此类研究。通过同时对双极细胞进行膜片钳记录，可以研究突触前膜电位与突触释放之间的关系^2,3. 通过共喷施染料和含有高浓度 K⁺ 的任氏液，将荧光染料（FM 1-43®）加载至双极细胞终末内的突触小泡中⁺浓度聚集到突触末梢，从而去极化细胞并刺激内吞作用，使染料随之进入谷氨酸能囊泡。在洗去多余染料约30分钟后，细胞即可用于同时进行膜片钳记录和488 nm激光成像。膜片电极内液含有基于罗丹明的肽段，该肽段可特异性结合突触带蛋白RIBEYE。⁴，从而在使用 561 nm 激光对终末进行成像时特异性地标记突触带。这使得能够精确定位活性区，并区分突触内与突触外事件。

方案

第一部分：解剖与双极细胞分离

1. 配制表2中列出的溶液；用NaOH将任氏液（外部）溶液的pH值调节至7.4，用CsOH将内部溶液的pH值调节至7.2；用铝箔包裹内部溶液以避光，并在4 °C下保存至使用；
2. 在解剖前，将金鱼在暗处适应至少30分钟；
3. 在动物暗适应期间，准备5 mL透明质酸酶溶液（V型透明质酸酶，1100单位/mL，溶于低Ca²⁺任氏液；Sigma，St. Louis，MO）和10 mL L-半胱氨酸溶液（0.5 mg/mL，溶于低Ca²⁺任氏液），并称取木瓜蛋白酶（冻干粉末，40单位/mL；Sigma，St. Louis，MO）用于配制5 mL消化液；
4. 使用手术剪迅速断头处死金鱼，并用#11手术刀片破坏脑和脊髓；
5. 使用#7弯头Dumont镊子破坏眼外肌，并用虹膜剪剪断视神经，以摘除眼球；
6. 将一只眼球置于滤纸上，用#11手术刀片尖端刺穿巩膜缘；
7. 将Vannas剪刀的刀片插入穿刺孔内，剪除整个前节部分；
8. 将一小片滤纸置于剩余的视杯上方，施加一定压力，使滤纸吸收玻璃体液；
9. 提起附有视网膜的滤纸，用Vannas剪刀剪断视神经；
10. 将带有视网膜的滤纸放入盛有透明质酸酶溶液的35 mm塑料培养皿中，并借助#7 Dumont镊子将视网膜从滤纸上剥离；
11. 使用工业碳素钢单刃刀片的一半将视网膜切成4–6片，并在透明质酸酶溶液中孵育20分钟；
12. 在等待透明质酸酶作用期间，向木瓜蛋白酶中加入5 mL L-半胱氨酸溶液，静置至液体变为透明（约5–10分钟）；
13. 用低Ca²⁺任氏液将视网膜组织片清洗3次，并在木瓜蛋白酶溶液中孵育30–35分钟；
14. 用低Ca²⁺任氏液将视网膜组织片清洗3次，随后在含有低Ca²⁺任氏液的35 mm塑料培养皿中于4 °C保存至使用；
15. 为解离细胞，将一片视网膜放入含有500 µL低Ca²⁺任氏液的微量离心管中，用玻璃解离移液管缓慢吹打上下数次以解离视网膜，注意避免产生气泡。解离移液管的制备方法为：用本生灯加热玻璃巴斯德移液管的尖端，并借助解剖镊子轻微弯曲；
16. 通过向自制记录室中加入一滴视网膜悬液来接种分离的细胞，该记录室预先加入2 mL低Ca²⁺任氏液。记录室由35 mm塑料培养皿的下半部分构成，其中部有一个圆形孔，底部粘附一片折射率为1.78的圆形盖玻片（PlanOptik，德国），使用硅弹性体（Sylgard 184；Dow Corning，Midland，MI）进行粘合。

第2部分：双极细胞加载与洗脱

使用具有高数值孔径物镜和高灵敏度相机的物镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜对突触小泡进行成像是最佳选择。在我们的实验中，选用数值孔径为1.65的物镜（Apo x100 O HR，N.A. 1.65，Olympus，日本）和电子倍增CCD相机（Cascade 512B，Roper Scientific，Tucson，AZ）。使用如此高数值孔径的物镜需要采用高折射率玻璃盖玻片和浸油（含硫的二碘甲烷）。在我们的实验条件下，激发光被限制在长度常数约为50 nm的指数衰减场内。

1. 在显微镜物镜上滴加一滴高折射率液体（M系列，折射率 = 1.7800，Cargille Labs，Cedar Grove，NJ）；
2. 小心将记录室置于显微镜物镜上方，并将接地电极和灌流出口管小心安装到记录室上；
3. 让记录室在显微镜上静置10–20分钟，使细胞沉降并贴附于底部；
4. 在此期间，准备5 mL含1 mM Trolox®（(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；Sigma，St. Louis，MO）的高K⁺任氏液，超声至完全溶解；
5. 准备15 mL ADVASEP-7洗涤液：将1 mM ADVASEP-7（Sigma，St. Louis，MO）溶于低Ca²⁺任氏液中。注意：ADVASEP-7的使用为可选，可根据需要省略；
6. 对灌流管路进行通气，并将ADVASEP-7洗涤液、低Ca²⁺任氏液和对照任氏液加入灌流系统；
7. 使用薄壁硼硅酸盐玻璃（Kwik-Fil® TW150-3；WPI，Sarasota，FL）拉制上样移液管。吹液移液管的电阻范围为1.5–2.5 MΩ；
8. 配制FM1-43®（N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物，“特殊包装”；Invitrogen，Carlsbad，CA）溶液。首先，将160 μL蒸馏水加入一支FM1-43®（100 mg）小瓶中，配制成1 mM储备液。该储备液可在4 °C保存最多一周。然后，取5 μL FM1-43®储备液加入1 mL高K⁺任氏液 + 1 mM Trolox®中。用铝箔避光保护溶液，并在4 °C保存至使用；
9. 打开显微镜明场光源，寻找完整的双极细胞。轻敲显微镜，确保神经元牢固贴附于记录室底部；
10. 将灌流笔置于目标细胞附近，并持续用低Ca²⁺任氏液灌流样本；
11. 关闭室内灯光，并在光路中加入红色长通滤光片（例如RG630；Schott，德国），以最大限度减少对FM染料的激发；
12. 用10 μL FM染料溶液填充一支上样移液管，将其安装至显微操作器上，并在无正压条件下将移液管缓慢下放至样本位置，使其与待加载的双极细胞处于同一焦平面。请确保至少有两个电极夹持器：用于FM染料的夹持器不可用于膜片钳实验，否则可能污染细胞内溶液；
13. 将吹液口置于轴突末梢约10 μm处，关闭灌流系统，并通过开启移液管正压吹入染料溶液10秒；
14. 关闭正压，在不移动移液管的情况下静置30秒；
15. 重新开启灌流系统，用ADVASEP-7溶液灌流记录室5分钟。在此期间，将吹液移液管从浴液中移出；
16. 5分钟后，切换为低Ca²⁺任氏液，并继续灌流25–30分钟，以清除多余染料。

第3部分：膜片钳与全内反射荧光显微成像

1. 在清洗样本的同时，使用厚壁硼硅酸盐玻璃管（B150-86-10；Sutter Instrument Company，Novato，CA）拉制膜片钳电极。膜片钳电极的电阻应处于 8–10 MΩ 范围内；
2. 清洗完成后，将轴突末梢置于视野中央；
3. 用 7 μL 内液填充膜片钳电极，轻敲电极以排除气泡，用熔化的牙科蜡（Sticky Wax；Kerr Corporation，Orange，CA）包裹电极，并将其安装至显微操作器上；
4. 开启电极正压，缓慢将电极下放至样本表面。在放大器中检测电极电阻，并使用放大器的相应控制功能校正电极偏移和电容；
5. 切换灌流液为正常任氏液。为在电极与细胞之间形成吉欧封接（gigaseal），可轻微触碰电极尖端至细胞体，随后关闭电极正压，同时向电极内施加轻柔的负压；
6. 封接形成后，在放大器中选择“全细胞”模式，并将细胞钳制电位设为 -60 mV；
7. 使用成像软件选择包含整个轴突末梢的兴趣区域，关闭明场光源，并通过短暂暴露（30 ms）末梢于 488 nm 激光下，确定全内反射荧光（TIRF）成像的最佳焦平面；
8. 在对电极施加轻微负压的同时，使用放大器的“zap”指令击穿细胞膜，进入全细胞记录模式；
9. 校正细胞电容和串联电阻，随后在成像突触囊泡运动的同时施加所需的电压刺激程序。此步骤中，确保电压刺激程序与相机帧率同步至关重要。在本实验中，每帧时长为 30 ms，因此电压变化以该值的整数倍进行（例如每 300 ms 或 10 帧）；
10. 每次实验之间至少等待 40 秒，以允许细胞恢复；
11. 为观察突触带的位置，可在开启 561 nm 激光的情况下拍摄图像。

图 1：实验装置示意图。488 nm 激光（蓝色）聚焦于物镜后焦面边缘，在到达玻璃-水介质界面时发生全内反射。反射光束产生的电磁场激发位于玻璃培养皿底部附近、突触囊泡中负载的荧光染料，使其发出荧光（绿色）。荧光信号随后被引导至观察者眼睛（图示）或 CCD 相机。同时通过膜片钳技术控制成像细胞的膜电位。该方法可用于研究输入信号（膜电压）与神经元输出（胞吐作用）之间的关系。

图 2： 典型实验结果。左侧：分离的金鱼双极细胞的明场图像。右上方：使用488 nm激光（FM染料）成像的双极细胞轴突末梢中被FM 1-43®标记的突触囊泡的全内反射荧光（TIRF）图像。右下方：对细胞进行膜片钳记录后，使用561 nm激光对同一末梢的轴突末梢进行成像的结果。突触带由基于罗丹明的RIBEYE结合肽（Rpep_rhod）标记。

表1： 特定试剂与设备。

名称	类型	制造商	目录	评论
-	气浮台	Newport Corporation	-	-
IX70	倒置显微镜	Olympus	-	配备钨灯用于明场成像，以及用于全内反射荧光（TIRF）的侧向开口端口
TH4-100	灯源电源	Olympus	-	-
FF498_581-Di01	二向色滤光片	Semrock	-	-
NF01-405_488_568	发射滤光片	Semrock	-	-
Apo x100 O HR	目标	Olympus	-	N.A. 1.65
RG630	红色玻璃滤光片	Schott	-	-
-	488 nm 激光器	相干	-	最低功率使用
-	快门	Uniblitz	-	-
VMM-D1	快门驱动器	Uniblitz	-	-
-	561 nm 激光器	Melles Griot	-	-
-	快门	Uniblitz	-	-
VMM-D3	快门驱动器	Uniblitz	-	-
灌注压试剂盒	灌流系统	自动化科学	09-04	-
灌注笔	灌流系统	自动化科学	-	-
Valvelink 8	灌流系统控制器	自动化科学	-	-
Cascade 512B	EM CCD相机	Roper Scientific	-	-
Metamorph 7.1	成像软件	Molecular Devices	-	-
EPC-9	膜片钳放大器	HEKA Elektronik	-	-
脉冲	放大器软件	HEKA Elektronik	-	-
MP-285	显微操作仪	Sutter Instrument	-	-
-	电极夹	HEKA Elektronik	-	对于1.5毫米外径玻璃管，使用2个单位
Kwik-Fil® TW150-3	硼硅酸盐毛细玻璃管	WPI	-	无纤维
B150-86-10	硼硅酸盐毛细玻璃管	Sutter Instrument	-	含细丝
P-97	微电极拉制仪	Sutter Instrument	-	配备 3x3 箱式灯丝和环境腔室
-	压力真空空气泵	托马斯科学公司	7893B05	产生真空以从腔室中移除液体，并提供移液器所需的正压
MatLab R2008a	分析软件	MathWorks	-	-
353001	35 mm 塑料培养皿	Falcon	-	-
-	高折射率玻璃	PlanOptik	-	折射率488 nm = 1.78
系列 M	高折射率液体	Cargille Labs	-	折射率 = 1.78
Sylgard 184	硅弹性体试剂盒	道康宁	-	-
谷胱甘肽	三肽	EMD Chemicals		自由基清除剂
透明质酸酶	酶	Sigma	H6254	V型
L-半胱氨酸	氨基酸	Fluka	30090	激活木瓜蛋白酶
木瓜蛋白酶	酶	Fluka	76220	从 番木瓜
Trolox®	可溶性维生素E	Sigma	56510	自由基清除剂
ADVASEP-7	磺化 B-环糊精衍生物	Sigma	A3723	降低FM 1-43®背景荧光
FM 1-43®	荧光染料	Invitrogen	T35356	特殊包装
粘性蜡	移液管涂层剂	Kerr Corporation	-	降低移液管电容

表2： 本研究中使用的生理溶液。

物质	低 Ca2+ Ringer 液	对照 Ringer 液	高 K+ Ringer 液	胞内溶液
NaCl	120 mM	120 mM	97.5 mM	-
KCl	2.5 mM	2.5 mM	25 mM	-
MgCl2	1 mM	1 mM	1 mM	4 mM
CaCl2	0.5 mM	2.5 mM	2.5 mM	-
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
EGTA	0.75 mM	-	-	0.5 mM
葡萄糖	10 mM	10 mM	-	-
谷胱甘肽	2 mM	2 mM	-	1 mM
CH3CsO3S*	-	-	-	100 mM
TEACl	-	-	-	10 mM
ATP-Mg	-	-	-	10 mM
GTP-Li	-	-	-	1 mM
Rpep-rhod**	-	-	-	5 mM
体积	200 mL	100 mL	5 μL	100 μL

* 甲磺酸铯。
** RIBEYE 结合肽：罗丹明+EQTVPVDLSVARDR-羧基（分子量 1997.75）。

讨论

物镜型全内反射荧光显微镜的优点包括：1）通过将激发光限制在物镜焦平面内的狭窄区域，实现优异的光学切片能力，从而最大限度地减少非焦平面光线的干扰；2）由于光强随距离呈指数衰减，因此可通过荧光强度的变化来监测垂直方向上的运动；3）利用高数值孔径物镜高效收集光线^1,5。

该技术的主要缺点是仅限于成像发生在100微米以内的事件& 细胞表面的纳米级结构，这大致相当于透射电镜中的超薄切片。因此，这些事件的可视化在很大程度上依赖于细胞牢固地贴附在玻璃表面、突触带接近贴附于玻璃的膜区域以及囊泡的成功加载。本方案仅能实现双极细胞突触终末中总囊泡数量的1–2%被成功加载。^2,6需要指出的是，细胞表面实际发生的事件远比我们能够成像的要多得多。