获得高质量且数量合适的胰岛是成功进行胰岛移植的重要前提之一。在本视频中，我们将逐步介绍使用改良的自动化方法分离人胰腺胰岛的步骤（第二部分：人胰岛的纯化与培养）。
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本文内容
摘要
摘要
1型糖尿病的管理对个人和社会而言都是一项沉重的负担，每年花费超过1000亿美元。尽管血糖监测和新型胰岛素制剂已广泛应用，许多患者仍会出现严重的继发性并发症。胰岛移植能够恢复糖尿病患者的近似正常血糖控制1，且不会出现与强化胰岛素治疗相关的严重低血糖发作风险。提供足够的胰岛组织量对于成功的胰岛移植至关重要。然而，供体特征、器官获取及保存过程均会影响胰岛分离的效果2. 在芝加哥伊利诺伊大学（UIC），我们开发了一种成功的分离方案，并优化了纯化梯度3. 该项目始于2004年1月，截至2008年11月已完成了300多次分离。胰腺组织以低温保存液（UW，威斯康星大学液或HTK，组氨酸-色氨酸-酮戊二酸液）送至实验室4-7送往伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）的细胞分离实验室进行胰岛分离。胰岛采用UIC方法进行分离，该方法是Ricordi最初描述的方法的改良版本。等 8如第一部分“胰腺组织的消化与收集”所述，人胰腺经过修剪、插管、灌注和消化处理。收集组织后，在UW溶液中至少孵育30分钟，随后将组织装入细胞分离机（COBE 2991，Cobe，Lakewood，CO）中进行纯化。3纯化后，根据标准方法测定胰岛产量（以胰岛当量，IEQ 表示）、组织体积和纯度。9分离的胰岛在CMRL-1066培养基（Mediatech，Herndon，VA）中培养，培养基中添加1.5%人血清白蛋白、0.1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、1 ml环丙沙星、5 ml 1M HEPES以及14.5 ml 7.5%碳酸氢钠，置于T175培养瓶中，于37°C过夜培养，之后用于移植或科研实验。
方案
1. 胰岛的纯化
- 开始胰岛纯化操作时，将COBE袋连接好，夹紧除绿色管以外的所有管路，并将转速设为1,500，超速排出（super out）设为0。
- 在生物安全柜内设置好泵和梯度烧杯，并将收集管路连接至绿色管。
- 现在开始加载ficoll 1.100：按下“spin”按钮，然后向前面的烧杯中加入110 ml Ficoll 1.100，并启动泵以将液体加载入COBE袋。当Ficoll开始加载后，按下超速排出按钮，停止泵，松开泵头夹子，并将超速排出速度设为100。
- 当Ficoll到达烧杯且管路中的空气完全排出后，重新在泵头处夹紧管路。将旋转速度设为3,000，超速排出速度设为0。
- 现在准备加载梯度液：将高密度梯度液倒入前面的烧杯中。略微松开两个烧杯之间的夹子以排除任何气泡，然后将低密度梯度液倒入后面的烧杯中。
- 打开磁力搅拌器，按下COBE仪器上的“spin”按钮，松开连接两个烧杯的管夹，并目视确认高密度和低密度梯度液正在混合。
- 一旦梯度液开始混合，启动离心机。等待一分钟，然后开启泵以加载混合后的梯度液。
- 加载组织时，让前面烧杯中的梯度液面降低，但不能过低以致空气进入加载管路，随后夹紧连接两个烧杯的管路，并加载组织样本。
- 继续加入剩余的组织样本。然后用50 ml洗涤液冲洗盛装组织的管子，并用该液体冲洗前面的烧杯。
- 当最后的组织进入COBE袋时，同时停止泵，松开泵头处的夹子，并夹紧袋上方的管路。继续离心5分钟。
- 在离心过程中，将12个收集管移至生物安全柜内并松开其管盖。将收集管路连接至黄色管，将无菌收集尖端插入锥形管1中。然后松开黄色管的夹子，夹紧绿色管。
- 当离心结束后，缓慢将超速排出调至100。在第1管中收集150 ml，然后在第2至第12管中各收集30 ml（总体积从200至230 ml）。
- 收集完成后，在COBE仪器上按下“STOP”按钮。至此纯化过程结束，可对胰岛进行评估和培养。
2. 取样与培养
- 收集纯化的胰岛组分后，从12个收集管中各取出一份样品，用二苯硫腙（Dithizone）染色。染色结果可显示哪些层含有高纯度胰岛，哪些层含有低纯度胰岛。
- 分别收集高纯度和低纯度组织，并各自合并。
- 离心并洗涤两次。第二次洗涤后，用终末洗涤液将每份体积调至250 ml。
- 为评估合并后的组分，首先从高纯度合并组分中取两份1 ml样品，从低纯度合并组分中取一份1 ml样品，分别转移至含有9 ml洗涤液的锥形管中。
- 然后将每支15 ml管中的1 ml样品转移至计数皿中，在显微镜下观察并计数细胞。
- 细胞计数后，根据以下公式计算培养胰岛所需的培养瓶数量：（总EIN / 胰岛纯度（小数形式））/（每瓶30,000 EIN）。例如，100,000个纯度为90%的胰岛需在4个培养瓶中培养。
- 将胰岛转移至T175培养瓶中，在37˚C、5% CO2的培养箱中进行培养。
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讨论
尽管人胰岛分离技术已取得显著进展，胰岛产量仍然存在高度变异性且难以预测。在成功进行酶消化后，为了获得足够的胰岛组织用于移植，消化后胰腺组织的纯化至关重要。推荐采用UIC纯化方法，因为该方法已被证明可实现高纯度人胰岛的更优回收。此外，单次Cobe离心运行可加载多达50 ml的消化组织，从而通过缩短整个分离过程所需时间，减少与缺血相关的人胰岛损伤。
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致谢
由伊利诺伊大学芝加哥分校、胰岛细胞资源中心NIH资助（RFA-RR 05-003）、克里斯托弗基金会、埃夫罗姆森基金会和特拉布斯基金会提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 离心机 | 设备 | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 细胞处理仪 | 设备 | Gambro. BCT | 2556 | 胰岛纯化 |
| MZ6 倒置显微镜 TLBD4.1 | 设备 | Leica Microsystems | 4103 | |
| 带2 mm网格的细胞培养皿 | 设备 | Nalge Nunc international | 174926 | 胰岛计数 |
| Digital Sight DS L1 | 设备 | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE袋 | 一次性设备 | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175培养瓶 | 一次性设备 | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| 威斯康星大学（UW）溶液 | 试剂 | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s缓冲盐溶液（HBSS） | 试剂 | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | 试剂 | Bichrom AG | L6155 | |
| M199培养基（洗涤液） | 试剂 | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| 终末洗涤/培养培养基 | 试剂 | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| 二苯硫腙 | 试剂 | Sigma-Aldrich | D5130 |
参考文献
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
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