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方法文章

电生理记录在 果蝇 胚胎

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DOI：

10.3791/1348

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2009年5月21日

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1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

本文内容

摘要

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。

摘要

Drosophila是一种用于研究胚胎发育和功能神经科学的首选遗传模型。传统上，这两个领域彼此孤立，拥有 largely 独立的历史和科学群体。然而，这些通常截然不同的领域之间的交汇点，正是在神经回路形成的最后阶段，功能性的电学信号特性的获得以及功能性化学突触分化的发育程序。这一交汇区域是研究中至关重要的领域。在Drosophila, 这些功能发育阶段发生在胚胎发生最后三分之一时期的 <8 小时内（在 25°C 下）。由于表皮分泌了一层坚韧且不可渗透的角质层，这一晚期发育阶段长期以来被认为难以进行研究。一项突破性进展是应用了可与水聚合的外科胶水，该胶水可局部施加于角质层，从而实现对晚期胚胎的可控解剖。通过背侧纵向切口，可将胚胎展平，暴露腹侧神经索和体壁肌肉，以便进行实验研究。随后可采用全细胞膜片钳技术，对可明确识别的单个神经元和体肌细胞进行记录。这些记录模式已被用于追踪神经元和肌肉中离子电流的出现与成熟过程以及动作电位的传导。通过分析影响这些电学特性的遗传突变体，可揭示离子通道及其相关信号复合物的分子组成，并初步探索功能分化的分子机制。其中特别关注的是中枢神经系统及外周突触连接的组装过程。谷氨酸能神经-肌肉接头（NMJ）最适于结合光学成像与电生理记录进行研究。使用玻璃吸吮电极刺激外周神经，同时在电压钳制的肌肉细胞中记录兴奋性接头电流（EJC）。该记录配置已被用于描绘突触功能分化的过程，并追踪突触前谷氨酸释放特性的出现与成熟。此外，可通过离子电泳或压力法将谷氨酸直接施加于肌肉表面，独立检测突触后特性，以测量谷氨酸受体区域的出现与成熟。因此，在胚胎突触形成过程中，可分别或联合监测突触前和突触后组分。该系统已被广泛用于分离和鉴定影响胚胎突触形成的遗传突变体，从而揭示调控突触连接特化及功能突触信号特性分化的分子机制。

方案

第1部分：设备与耗材

  1. 电生理记录 黑腹果蝇 胚胎操作首先需要熟练掌握胚胎解剖技术，相关技术已在另一段 JoVE 视频中进行描述。
  2. 电生理记录 果蝇 胚胎的记录采用标准的膜片钳记录配置。适用于多种其他样本的膜片钳记录设备和软件同样适用于对胚胎进行记录 果蝇 胚胎。因为 黑腹果蝇 胚胎在解剖过程中被粘附于盖玻片上，因此记录室应能容纳盖玻片。由于制备样本的厚度及其在盖玻片上的固定方式，需要使用具有优良微分干涉差（DIC）光学系统和长工作距离物镜的 upright 显微镜。
  3. 电生理记录使用两种类型的灌流液：1）“标准”（Jan and Jan，1976a）或“改良标准”（Broadie，2000）任氏液，这类溶液基于常用于其他无脊椎动物系统记录的溶液；2）“类血淋巴”（HL）任氏液（Stewart et al，1994），是标准任氏液与实测血淋巴离子浓度之间的折中方案 果蝇 血淋巴。需要注意的是，这些生理盐水均未能准确模拟在血淋巴中测得的离子浓度，因此不适合用于记录（Broadie, 2000）。标准生理盐水的成分为（单位：mM）：135 NaCl，5 KCl，4 MgCl₂。21.8 CaCl₂, 72 蔗糖, 5 TES, pH 7.2

第二部分：记录配置

  1. 进行生理学实验时，将分离的胚胎样本置于一个小型聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃）记录室（<0.5 ml）中，并使用配备微分干涉差显微镜（Nomarski）光学系统和长工作距离40–100倍（通常为40倍）水浸物镜的直立复式显微镜在透射光下观察（Broadie 和 Bate，1993a）。记录通常在室温以下（16–22°C）进行，在较高温度（22°C以上）时记录难度逐渐增加。我们通过降低房间温度而非直接冷却样本的方式来实现所需温度。
  2. 记录电极可由多种含纤维的玻璃材料（例如硼硅酸盐玻璃，外径1 mm）拉制而成，尖端需经火焰抛光，使其最终电阻达到5–10 MΩ。将一根氯化银接地导线置于浴液中。信号使用膜片钳放大器（例如Axopatch-1D，Axon Instruments）进行放大，经八极贝塞尔滤波器在2–10 Hz下滤波，随后在线采样或以数字方式存储以供后续分析。
  3. 传统的膜片钳记录通常在18°C下进行，电极由含纤维的硼硅酸盐玻璃拉制（尖端经热抛光至内径约1 µm）。记录来自已鉴定的多核肌纤维，在电压钳模式下进行（标准保持电位为–60至–80 mV）（Broadie 和 Bate，1993a–d；Broadie 等，1997；Fergestad 等，1999；Featherstone 等，2000）。电极内液成分（单位为 mM）为：120 KCl、20 KOH、4 MgCl2、0.25 CaCl2、5 EGTA、4 Na2ATP、36 蔗糖和5 TES，pH 7.2 缓冲。记录电极采用回填法充灌溶液。

第3部分：肌肉记录

  1. 原则上，该制备方法可用于记录任何胚胎肌肉的电活动。实际上，大多数记录集中于最内层肌肉层中的大型腹侧纵肌（Bate, 1990；Broadie 和 Bate, 1993a-c）。也有研究记录了该肌肉层的背侧和侧向肌肉（Kidokoro 和 Nishikawa, 1994；Auld 等, 1995；Nishikawa 和 Kidokoro, 1995；Baumgartner 等, 1996）。然而，大多数实验聚焦于四块腹侧纵肌（6、7、12、13），尤其是前腹部（A2-A3）的第6号肌肉。
  2. 在幼龄胚胎（<16 小时 AEL）中进行肌肉记录前无需酶处理。但在较晚期胚胎（>16 小时 AEL）中会形成肌肉鞘，必须在膜片钳记录前使用胶原酶去除（IV型胶原酶，1 mg/ml 溶于无双价阳离子的生理盐水中，室温下处理 0.5–2 分钟）。酶处理后，肌肉上的封接电阻通常 >1 GΩ。
  3. 可采用多种标准技术对胚胎肌肉进行膜片钳记录（Broadie 和 Bate, 1993a-c；Broadie 等, 1994, 1995, 1997；Nishikawa 和 Kidokoro, 1995）。任何标准膜片钳模式——细胞贴附式、膜内朝外式、膜外朝外式——均可用于记录肌肉或分离肌肉膜片中的单通道活动。在全细胞记录模式下记录到的自发性兴奋性突触电流（sEJCs）下降相中，通常可观测到单个谷氨酸受体通道活动（在 -60 mV 下约为 12 pA）。
  4. 大多数记录采用全细胞记录构型，可通过轻微负压或电“震击”从细胞贴附状态轻松实现。肌肉记录既可在电压钳模式（典型保持电位为 -60 至 -80 mV）下进行，也可在电流钳模式下进行。在较年轻的胚胎（<13 小时 AEL）中，由于胚胎肌管之间存在广泛的电耦合，难以有效实施电压钳制（Broadie 和 Bate, 1993a）；但在较晚发育阶段（14+ 小时 AEL）通常不再存在此问题（Ueda 和 Kidokoro, 1996）。
  5. 可采用制霉菌素穿孔式膜片钳记录来验证标准全细胞技术获得的记录结果（Broadie 和 Bate, 1993a）。穿孔溶液配制方法如下：将 10 mg Pluronic F-127（Molecular Probes p-1572）溶解于 20 ml DMSO 中，再将 10 mg 制霉菌素溶解于该溶液中制成母液。取 100 μl 母液加入 5 ml 过滤后的移液管溶液中，制成记录用溶液。通常在封接形成后 <3 分钟内获得全细胞电流。多数情况下串联电阻显著增加，细胞可能出现漏电流增大现象（Broadie 和 Bate, 1993a）。
  6. 成熟胚胎（及幼虫）肌肉中的全细胞电压门控电流包含五个显著组分（Wu 和 Haugland, 1985；Zagotta 等, 1988；Broadie 和 Bate, 1993b）：一种内向钙电流（ICa）和四种外向钾电流（Tsunoda 和 Salkoff, 1995），其中包括两种快速失活电流——电压门控电流（IA）和钙依赖性电流（ICF），以及两种延迟出现、非失活的电流——电压门控电流（IK）和钙依赖性电流（ICS）。可通过离子替换实验在电压钳条件下将这些电流从全细胞反应中分离出来（Broadie 和 Bate, 1993b）。

第4部分：神经肌肉接头刺激与记录

  1. 最常用且可靠的神经肌肉接头（NMJ）刺激方法是使用玻璃吸吮电极作用于节段性外周神经。吸吮电极可由多种含纤维的电极玻璃（外径1-1.5 μm）拉制而成，并应进行火焰抛光以获得理想构型（内径约5 μm）。通过轻柔的负压，将适当节段运动神经的一小段（<50 μm）吸入移液管中，以形成紧密封接。
  2. 通常可通过在外周神经靠近中枢神经系统（CNS）出口处吸入一小段神经环路来刺激完整神经。该方法便于对完整标本进行刺激，但缺点是自发的中枢神经系统诱发活动可能叠加在施加的刺激范式之上。另一种方法是刺激切断的运动神经。若移除中枢神经系统则可实现此方法，但该操作容易拉伸神经并可能造成损伤。也可使用锋利的玻璃微电极切断神经，但此过程繁琐且困难。建议从完整标本中获取记录。
  3. 刺激可采用多种范式进行。短暂刺激（0.2-1毫秒）效果最佳，刺激强度（通常为1-5 V）取决于吸吮电极的构型，需针对每个细胞通过实验确定。通过将刺激强度设置为略高于阈值（+1-2伏），可实现对运动神经的超阈值刺激。诱发的神经肌肉接头反应如上所述从膜片钳制的肌肉细胞中记录。使用隔离的虚拟接地可显著减小电击伪迹。
  4. 相较于标准的吸吮电极神经刺激，一种可靠性较低的替代方法是直接刺激中枢神经系统（Nishikawa和Kidokoro，1995）。将充满3-4 M KCl（或KAc）的微电极插入腹神经节中部，并施加强度约为2微安、持续时间约为2毫秒的正向脉冲（Dietcher等，1998）。电极尖端应置于希望刺激的半节段最近的神经纤维网区域。突触传递在膜片钳制的肌肉细胞中以标准构型记录。
  5. 在整个分化过程中，胚胎期神经肌肉接头均可进行全细胞膜片钳记录。对于兴奋性接合电流（EJC）记录，使用标准膜片钳放大器采集信号，经滤波（通常为1-2 kHz），通过模数转换接口转换为数字信号，并利用适当的软件由计算机采集。

第5部分：神经肌肉接头的化学物质与药物应用

  1. 任何小分子带电分子均可通过离子电渗法有效施加到胚胎神经肌肉接头（NMJ）上（Aravamudan 等，1999；Fergestad 等，1999，2001）。可根据特定构型拉制离子电渗移液管，并使用负电流或正电流脉冲进行不同时长的应用。必须通过适当的反向维持电流防止脉冲间的泄漏（Broadie 等，1993d；Featherstone 等，2002，2005；Rohrbough 等，2007）。该维持电流的大小随移液管构型而变化，需通过实验确定。
  2. 已有大量实验使用 NMJ 的神经递质 L-谷氨酸（Jan 和 Jan，1976b），采用 100 mM 储备液（单钠盐；pH 8–9）（Broadie 和 Bate，1993c）。高阻抗离子电渗移液管（100–200 MΩ）已用于谷氨酸受体（gluR）定位作图（Broadie 和 Bate，1993d），而低阻抗移液管（20–50 MΩ）则用于估算总的 gluR 反应（Broadie 等，1995，1997；Featherstone 等，2002，2005；Rohrbough 等，2007）。短时负电流脉冲（0.1–1 ms，约 10 nA）效果良好，同时施加微弱的正向维持电流以防止泄漏。
  3. 无论是否带电的分子均可通过压力喷射法施加（Fergestad 和 Broadie，2001；Featherstone 等，2001）。施加时，将含有溶液的压力喷射移液管（内径 <5 μm）置于神经末梢附近（距离 <10 μm）。可通过皮升喷射仪（5–10 psi）或其他加压气源施加待喷射溶液（Featherstone 等，2002）。在长时间实验过程中，记录室（体积 <0.5 ml）应持续灌流正常浴液（流速 0.1–0.2 ml/sec）。
  4. 已有大量实验使用高渗盐水以触发突触囊泡的融合（Broadie 等，1995；Aravamudan 等，1999；Fergestad 等，1999；Featherstone 等，2000，2002）。其他实验则使用毒素，例如针对谷氨酸受体的 argiotoxin 636 以及含有 latroinsectotoxin 的黑寡妇蜘蛛毒液（Broadie 等，1995）。

第6部分：神经肌肉接头活力成像的补充技术

  1. 可使用荧光脂溶性苯乙烯染料监测突触小泡的动力学（Fergestad 和 Broadie，2001；Rohrbough 等，2004）。可直接观察小泡的分布，并测量内吞和外排速率。已有多种具有不同荧光特性的染料变体（FM1-43，类似荧光素；FM4-64，类似罗丹明）。对原始染料的修饰产生了具有不同疏水性质的产物，因而具有不同的洗脱动力学；例如，FM2-10 从膜上解离的速度要快得多。
  2. 为用苯乙烯染料标记胚胎期神经肌肉接头（NMJ），可在高浓度细胞外钾离子（50–90 mM）条件下孵育 10 µM FM1-43 染料 1–5 分钟（Fergestad 和 Broadie，2001）。也可通过神经负压电极刺激实现更接近生理状态的标记方法。随后将样本在无 Ca2+ 缓冲液中反复清洗 5 分钟，并测量残留荧光（代表被染色的突触小泡）。为测量外排过程，可通过高钾或电刺激神经来卸载染料。
  3. 已开发出带有 GFP 变体的融合蛋白，可用于胚胎期 NMJ 突触的多色标记（Brand，1999；Zhang 等，2002）。目前已有多种表达 GFP 标签蛋白的转基因品系，包括通用膜标记物（如 mCD8-GFP）、突触后标记物（如 Shaker-GFP、GluRIIA-GFP）、细胞骨架标记物（如 actin-GFP、moesin-GFP、tubulin-GFP）和线粒体标记物（如 Cytochrome C-GFP），以及突触小泡标记物（如 synaptobrevin-GFP、synaptotagmin-GFP；Zhang 等，2002）。
  4. GFP 报告基因可标记高度动态的细胞区室，可用于评估发育特征或突变体表型（Featherstone 和 Broadie，2000）。光漂白后观察荧光恢复（FRAP）的方法已被证明是可行的，至少在幼虫期 Drosophila NMJ 上如此（Zhang 等，2002；Yan 和 Broadie，2007）。但需注意：部分此类标记物无法完全挽救功能缺失突变体，甚至可能改变正常的 NMJ 生理功能。

第7部分：中枢运动神经元记录

  1. 许多胚胎神经元可根据胞体位置和投射形态进行个体识别（Bate 和 Martinez-Arias，1993；Goodman 和 Doe，1993；Landgraf 等，1997）。此外，GAL4/UAS 系统（Brand 和 Perrimon，1993）可用于靶向表达 GFP，以可视化可识别的神经元群体（Baines 等，1998）。迄今为止的记录研究主要集中于胚胎腹神经索（VNC）中一组五个位于浅层背侧的神经元，包括四个运动神经元（aCC 和 RP1-4）和一个中间神经元 pCC（Baines 等，1998，1999，2001；Rohrbough 和 Broadie，2002；Featherstone 等，1995）。
  2. 已知神经元的胞体可被全细胞膜片钳记录电极触及。首先需用蛋白酶进行短暂的局部处理，以去除腹神经索（VNC）的神经鞘膜（Baines 和 Bate，1998；Baines 等，1999；Rohrbough 和 Broadie，2002）。通过使用大直径（约 20 µm）的膜片钳移液管，内含 0.5–1% 蛋白酶（XIV 型，Sigma，溶于记录用生理盐水中），暴露背侧神经元胞体。通过负压将中枢神经系统鞘膜组织吸入移液管尖端，持续 1–2 分钟，直至鞘膜破裂（Featherstone 等，1995）。为在记录过程中确认细胞身份，可在膜片钳溶液中加入荧光黄（双钾盐，1–2 mg/ml），以可视化细胞的位置与形态。
  3. 可进行标准的全细胞电压钳和电流钳记录（Rohrbough 和 Broadie，2002；Featherstone 等，2005）。外部记录灌流液（单位：mM）包含：140 NaCl，3 KCl，2 CaCl₂，10 HEPES，pH 7.15。2，4 MgCl2，5 HEPES，10 蔗糖，2 NaOH（pH 7.2）。膜片钳溶液包含（单位：mM）：140 K-醋酸盐，2 MgCl₂2，0.1 CaCl₂，10 HEPES，1.1 EGTA，2 Na₂-ATP，约6 KOH（pH 7.2）。电压钳记录在-60 mV的保持电位和18 °C条件下进行。典型的未校正静息电位范围为-45至-65 mV（-52.9 ± 7.5 mV，均值±标准差，n = 78）。
  4. 现有的检测方法可揭示电压门控离子电流（Baines 和 Bate，1998）、重复性动作电位、突触介导的活动以及激动剂门控反应（Baines 等，2001）。运动神经元的突触输入表现为两种形式：一种是由动作电位（AP）介导的快速兴奋性突触电流（ESCs），另一种是每分钟发生数次或更多、周期性且持续时间可达1秒的持续性兴奋性输入（Baines 等，1999；Baines 等，2001）。
  5. 细胞胞体对离子电渗法施加的乙酰胆碱（ACh）以及抑制性递质GABA有反应（Baines and Bate, 1998；Featherstone et al. 2005）。可通过尖锐微电极以离子电渗方式将ACh施加于神经元胞体，该微电极内含100 mM ACh的dH₂O溶液20，在 pH 4–5 条件下以利于通过正电流进行激动剂离子电渗。

代表性结果

腹侧纵行肌6（位于A2-A3节段）是最常用于记录的靶标（Broadie 和 Bate，1993a-d；Harrison 等，1994；Sweeney 等，1995；Renden 等，2001；Huang 等，2006；Mohrmann 等，2008）。在成熟胚胎及新孵化的一龄幼虫中（25°C下孵化时间为20-21小时 AEL），肌6的全细胞电容通常为25-30 pF，输入电阻为20-40 MΩ，并随发育年龄而变化。神经肌肉接头（NMJ）突触电流的最大值从几十皮安（13-14小时 AEL）迅速增加至1-2 nA（20-21小时 AEL），随年龄增长而快速上升。对谷氨酸门控电流的直接测量显示，其最大反应从几百皮安（13-14小时 AEL）增至孵化前的1.5-4 nA。串联电阻误差（总电流 × 串联电阻）通常<5 mV，但在成熟、孵化前的胚胎中可能高达10+ mV，因此建议进行串联电阻补偿。平均直径为10-30 μm、平均长度为40-80 μm的胚胎肌肉表现出近乎理想的电压钳空间钳制参数。细胞钳制时间常数（Rseries × Ccell）平均小于0.25毫秒。

在成熟胚胎和新孵化的幼虫中，对背侧运动神经元群体的记录研究相对有限。神经元胞体记录显示，全细胞电容范围为1.8–2.5 pF（平均2.0 pF），串联电阻为40–60 MΩ，输入电阻约为5 GΩ（Baines 和 Bate，1998；Featherstone 等，2005）。这些细胞在胚胎成熟过程中明显增大并变得更加复杂，且这种生长在幼虫发育期间持续进行。在三龄幼虫中，全细胞电容为17–20 pF，串联电阻为25–37 MΩ，输入电阻平均约为900 MΩ（Rohrbough 和 Broadie，2002；Richard Baines，个人通讯）。离子电导在整个发育过程中逐渐增加，但电流密度（pA/pF）却保持显著恒定。在成熟胚胎中，突触电流的平均幅度为75–100 pA，包含快速兴奋性突触事件以及持续时间平均约为500毫秒的长时间电流（Baines 和 Bate，1998；Featherstone 等，2005）。在胚胎阶段，这些持续性事件平均每分钟发生3–5次，在一龄幼虫中增加至每分钟约20次（Richard Baines，个人通讯）。需要注意的是，黑腹果蝇（Drosophila）神经元的形态复杂性和膜特性使得对胞体以外大部分细胞区域进行准确的电压钳制几乎不可能。因此，应对记录结果的解释保持谨慎。

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讨论

对果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录需要手动操作和解剖。制备样本的健康状况以及记录质量，取决于操作者能否快速而整齐地准备好脆弱的胚胎组织，随后顺利开展实验。实验人员在尝试同时进行胚胎解剖和膜片钳电生理记录之前，应已熟练掌握这两项技术。

记录可在多种“改良标准”或“血淋巴样”（HL）任氏液中进行。这两类任氏液的主要区别在于：1）Na+ 浓度（标准任氏液为 120–135 mM，HL 任氏液为 70 mM）；2）Mg2+ 浓度（标准任氏液为 4 mM，HL 任氏液为 20 mM）。标准任氏液中较高的 Na+ 浓度主要优势在于促进动作电位的传导，从而维持正常的、有节律的突触传递。而 HL 任氏液则会抑制由动作电位介导的突触传递。Mg2+ 的差异会阻断电压门控钙通道，从而改变突触传递的幅度，并使 HL 任氏液中突触传递对 Ca2+ 依赖性的范围向更高浓度偏移（Stewart 等，1994）。因此，在相同 [Ca2+] 条件下，H...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

K.B. 由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM54544 支持。

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参考文献

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