电生理记录在 果蝇 胚胎

摘要

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。

摘要

Drosophila是一种用于研究胚胎发育和功能神经科学的首选遗传模型。传统上，这两个领域彼此孤立，拥有 largely 独立的历史和科学群体。然而，这些通常截然不同的领域之间的交汇点，正是在神经回路形成的最后阶段，功能性的电学信号特性的获得以及功能性化学突触分化的发育程序。这一交汇区域是研究中至关重要的领域。在Drosophila, 这些功能发育阶段发生在胚胎发生最后三分之一时期的 <8 小时内（在 25°C 下）。由于表皮分泌了一层坚韧且不可渗透的角质层，这一晚期发育阶段长期以来被认为难以进行研究。一项突破性进展是应用了可与水聚合的外科胶水，该胶水可局部施加于角质层，从而实现对晚期胚胎的可控解剖。通过背侧纵向切口，可将胚胎展平，暴露腹侧神经索和体壁肌肉，以便进行实验研究。随后可采用全细胞膜片钳技术，对可明确识别的单个神经元和体肌细胞进行记录。这些记录模式已被用于追踪神经元和肌肉中离子电流的出现与成熟过程以及动作电位的传导。通过分析影响这些电学特性的遗传突变体，可揭示离子通道及其相关信号复合物的分子组成，并初步探索功能分化的分子机制。其中特别关注的是中枢神经系统及外周突触连接的组装过程。谷氨酸能神经-肌肉接头（NMJ）最适于结合光学成像与电生理记录进行研究。使用玻璃吸吮电极刺激外周神经，同时在电压钳制的肌肉细胞中记录兴奋性接头电流（EJC）。该记录配置已被用于描绘突触功能分化的过程，并追踪突触前谷氨酸释放特性的出现与成熟。此外，可通过离子电泳或压力法将谷氨酸直接施加于肌肉表面，独立检测突触后特性，以测量谷氨酸受体区域的出现与成熟。因此，在胚胎突触形成过程中，可分别或联合监测突触前和突触后组分。该系统已被广泛用于分离和鉴定影响胚胎突触形成的遗传突变体，从而揭示调控突触连接特化及功能突触信号特性分化的分子机制。

方案

第1部分：设备与耗材

1. 电生理记录 黑腹果蝇 胚胎操作首先需要熟练掌握胚胎解剖技术，相关技术已在另一段 JoVE 视频中进行描述。
2. 电生理记录 果蝇 胚胎的记录采用标准的膜片钳记录配置。适用于多种其他样本的膜片钳记录设备和软件同样适用于对胚胎进行记录 果蝇 胚胎。因为 黑腹果蝇 胚胎在解剖过程中被粘附于盖玻片上，因此记录室应能容纳盖玻片。由于制备样本的厚度及其在盖玻片上的固定方式，需要使用具有优良微分干涉差（DIC）光学系统和长工作距离物镜的 upright 显微镜。
3. 电生理记录使用两种类型的灌流液：1）“标准”（Jan and Jan，1976a）或“改良标准”（Broadie，2000）任氏液，这类溶液基于常用于其他无脊椎动物系统记录的溶液；2）“类血淋巴”（HL）任氏液（Stewart et al，1994），是标准任氏液与实测血淋巴离子浓度之间的折中方案 果蝇 血淋巴。需要注意的是，这些生理盐水均未能准确模拟在血淋巴中测得的离子浓度，因此不适合用于记录（Broadie, 2000）。标准生理盐水的成分为（单位：mM）：135 NaCl，5 KCl，4 MgCl₂。₂1.8 CaCl₂, 72 蔗糖, 5 TES, pH 7.2

第二部分：记录配置

1. 进行生理学实验时，将....

讨论

对果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录需要手动操作和解剖。制备样本的健康状况以及记录质量，取决于操作者能否快速而整齐地准备好脆弱的胚胎组织，随后顺利开展实验。实验人员在尝试同时进行胚胎解剖和膜片钳电生理记录之前，应已熟练掌握这两项技术。

记录可在多种“改良标准”或“血淋巴样”（HL）任氏液中进行。这两类任氏液的主要区别在于：1）Na⁺ 浓度（标准任氏液为 120–135 mM，HL 任氏液为 70 mM）；2）Mg²⁺ 浓度（标准任氏液为 4 mM，HL 任氏液为 20 mM）。标准任氏液中较高的 Na⁺ 浓度主要优势在于促进动作电位的传导，从而维持正常的、有节律的突触传递。而 HL 任氏液则会抑制由动作电位介导的突触传递。Mg²⁺ 的差异会阻断电压门控钙通道，从而改变突触传递的幅度，并使 HL 任氏液中突触传递对 Ca²⁺ 依赖性的范围向更高浓度偏移（Stewart 等，1994）。因此，在相同 [Ca²⁺] 条件下，H.......