我们描述了一种从0.22 μm Sterivex滤膜上浓缩的浮游生物生物量中提取高分子量基因组DNA的方法，随后通过氯化铯密度梯度离心进行纯化。
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摘要
摘要
该方法用于从已用储存/裂解缓冲液处理并储存在-80°C的0.22 μm Sterivex滤膜上浓缩的浮游生物生物量中提取高分子量基因组DNA，并通过氯化铯密度梯度纯化该DNA。本方案首先进行两个各一小时的孵育步骤，以释放细胞中的DNA并去除RNA。随后进行一系列苯酚:氯仿和氯仿抽提，并通过离心去除蛋白质和细胞膜组分，收集水相DNA提取物，并通过多次缓冲液置换步骤对提取物进行洗涤和浓缩。第五部分描述了可选的氯化铯密度梯度纯化步骤。建议每次处理少于15个样本，以避免混淆并缩短操作时间。本方案所需的总时间取决于待提取样本的数量。对于10至15个样本，且假定具备适当的离心设备，整个流程应耗时3天。请确保在实验开始前已将杂交炉预热至设定温度。
方案
注意：本方案中使用的所有试剂均从实验室原液分装为较小体积的工作液——这对于避免DNA样本之间的交叉污染以及防止实验室原液被污染至关重要。此外，在移液操作时，每次加样都必须更换移液器吸头，以避免交叉污染。
第一部分：细胞裂解与消化
- 首先将含有先前浓缩浮游生物量的 Sterivex 滤器在冰上解冻，以启动本实验方案。为简便起见，此处以单个滤器的处理流程为例进行说明。实际操作中，建议每次处理不超过 16 个滤器。
- 待滤器完全解冻后，开始进行两步孵育中的第一步：第一步用于裂解细胞并去除 RNA，第二步用于降解蛋白质。对于第一步孵育，向滤器中加入 100 μl 溶菌酶（125 mg 溶于 1000 μl TE 缓冲液）和 20 ml 核糖核酸酶 A（RNase A，10 μg/ml）。用 Parafilm 密封滤器，置于杂交炉中 37°C 下旋转孵育 1 小时。
- 进行下一步孵育时，向滤器中加入 100 μl 蛋白酶 K 和 100 μl 20% 十二烷基硫酸钠（SDS）。再次用 Parafilm 密封，置于杂交炉中 55°C 下继续旋转孵育 1 至 2 小时。
- 使用 5 cc 注射器将裂解液从 Sterivex 滤器转移至 15 ml Falcon 管中。用 1 ml 裂解缓冲液冲洗滤器，并使用 5 cc 注射器将冲洗液加入 Falcon 管中的裂解液内。至此，细胞已完全裂解并消化，可进行 DNA 提取。
第二部分：DNA 提取
- 下一步是使用苯酚-氯仿法从裂解液中提取 DNA。向裂解液管中加入等体积（约 3 ml）的苯酚:氯仿:异戊醇（IAA），每次添加时务必更换移液器吸头，以避免交叉污染。涡旋振荡 10 秒，充分混匀。
- 将管子在 2500 g 条件下离心 5 分钟，确保离心机已平衡。离心过程中，苯酚-氯仿-裂解液混合物会分为两层：下层为有机相，包含苯酚、氯仿以及样品中的蛋白质；上层为水相，含有 DNA、水及其他亲水性较强的分子。
- 将上层水相（含 DNA）转移至一个新的 15 ml Falcon 管中。操作时注意不要让移液器吸头接触两相界面（始终保留少量水相液体）。
- 向此新管中加入等体积（约 3 mL）的氯仿:IAA，每次添加时务必更换移液器吸头，以避免交叉污染。涡旋振荡 10 秒。此步骤有助于去除 DNA 样品中残留的苯酚。
- 在 2500 g 条件下离心 5 分钟，或直至水相变得澄清。将水相转移至一个新的、已标记的 Falcon 管中，并加入 1 ml pH 8.0 的 TE 缓冲液，操作时注意不要触碰界面（始终保留少量水相液体）。此水相即为提取的 DNA 样品。
第三部分：DNA 浓度测定与洗涤
- 下一步是将 DNA 样本转移至 15 ml Amicon Ultra 离心管中进行洗涤和浓缩。Amicon 管包含一个滤膜，可截留等于或大于指定分子量的分子（截留物），以及一个用于收集流穿液（滤穿液）的管体。在此步骤中，滤膜将截留您的 DNA（即截留物）。将步骤 2.5 中获得的 DNA 提取物转移至 Amicon Ultra 管的滤膜室中。
- 在 3500 g 条件下离心 10 分钟。检查 Amicon 滤膜中残留液体是否少于 1 ml。若仍有较多截留物残留，需用 TE 缓冲液重新填充滤膜并再次离心。每次添加 TE 缓冲液时务必使用新的移液器吸头，以避免交叉污染。
- 将流穿液（即滤穿液）转移至另一个 Falcon 管中，并在冰箱中保存，直至您在琼脂糖凝胶电泳中确认最终 DNA 产物（第四部分）。
- 向 Amicon 滤膜中加入 2 ml TE 缓冲液，在 3500 g 条件下离心 6 分钟，每次添加 TE 缓冲液时均需使用新的移液器吸头，以避免交叉污染。将此次获得的滤穿液与步骤 3.3 中收集的滤穿液合并，并保存于冰箱中。
- 用 TE 缓冲液对 DNA 进行额外两次洗涤，共完成三次洗涤（每次添加 TE 缓冲液时均需使用新的移液器吸头），并每次保留滤穿液（参照步骤 3.3 和 3.4）。最后一次洗涤时，离心至 Amicon 滤膜中剩余 200 至 500 µl 截留物。记录最终体积，并将截留物（含您的 DNA）转移至已标记的 1.5 ml Eppendorf 管中。
第四部分：DNA 质量的测定
- 通过将样品在含有1ml溴化乙锭（EtBr）的0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA质量并估算其浓度，建议过夜染色。（使用EtBr时需格外小心——其为已知的诱变剂并可能具有致癌性。务必频繁更换手套，避免EtBr污染实验室其他区域或接触皮肤。）将样品与DNA分子量标记物（ladder）一同上样，后者用于作为大小和亮度的标准参照（见下一步）。
- 在前几条泳道中，加载具有不同分子量和浓度条带的ladder。推荐以下上样模式：在第一和最后一条泳道（最外侧泳道），各加入10 μl浓度为50 ng/μl的1kb+或2log DNA ladder；在第2、3、4条泳道中，分别加入2 μl、5 μl和10 μl的50 ng/μl λHindIII ladder。最后，每个样品加入含染料的5 μl DNA提取物上样。
- 以15伏电压电泳约16小时（建议过夜运行）。
- 次日，使用紫外凝胶成像系统拍摄凝胶图像。通过将样品条带与ladder条带进行比较，确定DNA的分子量范围及其浓度。高质量的DNA应具有较高的分子量（>36 kb），且几乎无剪切或降解迹象。参见图1。
第五部分：氯化铯梯度离心
- 如果DNA质量良好且数量充足，可进行氯化铯（CsCl）梯度离心以纯化DNA。请注意，此纯化步骤为可选步骤，并非所有下游应用均需执行（例如，若要构建fosmid文库，则必须进行纯化；而若仅进行PCR反应，则通常无需纯化）。首先，为每个样品标记一个离心管。
- 向每个离心管中加入160 mg CsCl和178 μl基因组DNA。加入CsCl和DNA后，在管口覆盖一小块封口膜，轻轻倒置管子10至20次以混匀组分。切勿使用移液器混匀，以免造成DNA剪切。接着，向管中加入10 μl浓度为10 μg/μl的溴化乙锭（EtBr），并以相同方式混匀。（使用EtBr时务必极其小心——其为已知诱变剂和疑似致癌物。应频繁更换手套，避免EtBr污染实验室其他区域或接触皮肤。）
- 离心前确保所有离心管重量平衡，各管之间的重量差异应小于1 mg。
- 使用止血钳将离心管放入转子中，盖上转子盖，并将转子放入超速离心机内。
- 关闭超速离心机门。关门后将自动抽真空。在100,000 rpm、20°C条件下运行过夜，持续18小时。
- 离心完成后，使用止血钳将离心管从转子中取出，并置于试管架上。
- 在暗室中使用蓝光透射仪观察DNA；若无此设备，可使用长波长紫外光。佩戴琥珀色滤光眼镜以清晰观察DNA条带。参见图2。
- 使用无菌1 cc注射器和针头（26G 5/8），吸取DNA条带并转移至1.5 ml Eppendorf管中。
- 为回收滞留在注射器死体积中的大部分DNA，用100 μl TE缓冲液冲洗注射器，并将冲洗液加入同一Eppendorf管中。每份样品准备一支含100 μl TE缓冲液的独立试管，以防止交叉污染。
- 为去除DNA中的EtBr，向管中加入等体积的水饱和正丁醇，轻轻倒置混匀10至20次，于10,000 rpm离心1分钟，弃去上层液体。
- 重复洗涤3至4次，直至正丁醇层变为无色透明。
- 在Amicon Ultra离心管中加入4 ml TE缓冲液，然后将上述DNA溶液加入其中。
- 室温下以3500 g离心，直至DNA体积浓缩至约100–500 μl（约需6–7分钟），弃去滤过液。
- 向Amicon滤膜中加入2 ml TE缓冲液，以3500 g离心6分钟，每次加液务必使用新的移液器吸头，以防交叉污染。重复此步骤两次。
- 根据需要进一步离心，将DNA浓缩至终体积50–100 μl，并将滤膜上的DNA溶液转移至新的1.5 ml Eppendorf管中。
- 向Amicon滤膜中加入40 μl TE缓冲液，沿滤膜两侧反复吹打，以洗脱残留的DNA。将此溶液加入步骤5.15中的Eppendorf管中。
- 将Microcon YM-30滤膜装置倒置放入新的Microcon收集管中，加入200 μl经高压灭菌的水，以10,000 rpm离心7分钟，进行预清洗。
- 将步骤5.16所得DNA溶液加入已预清洗的Microcon滤膜中，以进一步浓缩DNA。以5000–10000 g离心1–3分钟。检查滤膜上液体量，重复离心直至滤膜上液体体积减少至约50 μl。
- 将滤膜装置倒置放入新的Microcon收集管中，以1000 g离心3分钟。理想浓缩体积为50–60 μl。
- 使用Nanodrop测定并记录DNA浓度，并检查吸收峰质量（应在260 nm处出现峰值）。
- 取少量DNA溶液转移至洁净的Eppendorf管中作为工作储备液，于–20°C冷冻保存；将剩余DNA转移至另一洁净Eppendorf管中，于–80°C冷冻保存。
代表性结果：
当本实验方案正确执行时，在“DNA质量鉴定”部分的步骤4.4之后，应观察到与图1相似的凝胶图像。提取物的实际DNA浓度将因样本来源不同而有所差异。在氯化铯梯度离心的步骤5.7之后，经蓝光照射的基因组DNA应呈现与图2相似的外观。
图 1. 从亚北极太平洋四个深度采集的高分子量DNA（每个样本设两个重复）进行0.8%琼脂糖凝胶电泳的结果图像，使用嵌入染料溴化乙锭（10 mg/ml）染色。凝胶在1× TBE电泳缓冲液中以15 V电压电泳约16小时。样品条带质量良好，几乎无机械剪切迹象（表现为单一条带或弥散条带，而非多条带），尽管10 m深度的提取物仍残留部分RNA（见0.5至2.0 Kb范围内的弥散条带）。
图2.经CsCl梯度离心后，基因组DNA条带在蓝光照射下显现。
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讨论
根据待处理样本的数量，该实验过程可能耗时较长，因为包含两个一小时的孵育步骤，以及多次洗涤和离心步骤。建议为此实验安排完整的两天时间，以确保有充足的操作时间。如果在DNA浓缩和洗涤过程中，难以将Amicon管中的最终提取液体积浓缩至200–500 μL，可尝试增加TE缓冲液洗涤和离心步骤（重复第三部分），直至剩余体积达到要求。此外，如果提取液有明显的氯仿气味，建议继续进行额外的洗涤，直到气味减弱，以确保完全去除氯仿。再次强调，本实验方案中使用的所有试剂均应从实验室储备液中分装为小份工作液，这一点非常重要，可有效避免DNA样本之间的交叉污染以及对实验室储备液的污染。同时，在移液操作中，每次添加试剂时务必更换移液器吸头，以防止交叉污染。
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致谢
我们感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）对沿海和开阔海域低氧区域持续研究的支持。J.J.W. 获得了来自 NSERC 的博士后奖学金支持，D.A.W. 获得了来自 NSERC、Killam 以及由 TULA 基金会资助的微生物多样性与进化中心的奖学金支持。S.L. 获得了由 TULA 基金会资助的微生物多样性与进化中心的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 cc 注射器（26G5/8 针头） | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml 注射器（26G5/8 针头） | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5 ml 离心管 | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15 ml 管 | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5 cc 注射器 | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 离心过滤装置 | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 标称分子量截留值 |
| 丁醇 | Fisher Scientific | A383-1 | 配制成水饱和丁醇（丁醇:水 = 1:1） |
| 离心机转子，JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| 离心机，Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| 氯化铯 | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| 氯仿:异戊醇（24:1） | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| 溴化乙锭（EtBr） | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| 杂交炉 | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| 裂解缓冲液 | 0.75 M 蔗糖，40 mM EDTA，50 mM Tris（pH 8.3） | ||
| 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg 溶于 1000 μl TE 缓冲液 |
| Microcon® Ultracel YM-30 离心过滤单元 | EMD Millipore | 42410 | 50 bp 截留 |
| Parafilm 封口膜 | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1） | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| 蛋白酶 K | Qiagen | 19133 | |
| 核糖核酸酶 A（RNase A） | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ 蓝光透射仪 | Invitrogen | S37102 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex 滤器 | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5415D | |
| TE 缓冲液，pH 8.0 | |||
| Trizma® 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 超速离心机转子，TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| 超速离心管（7×20 mm，PC） | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| 超速离心管架 | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| 超速离心机，Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
参考文献
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
