蜜蜂可通过 appetitive 嗅觉学习范式（PER-conditioning）进行条件化训练。利用气味作为刺激，我们建立了一种方法，在记录行为的同时，结合钙成像技术检测蘑菇体神经元中由气味诱发的神经活动。 体内.
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本文内容
摘要
摘要
本实验室十余年前由 Joerges、Küttner 和 Galizia 建立了用于钙成像的 in vivo 和 semi-in vivo 制备方法，以检测触角叶中由气味诱发的神经活动1。此后，该方法被持续优化，并应用于蜜蜂脑中的不同神经节。本文描述了目前实验室用于检测蘑菇体神经元活性的制备方法，采用与葡聚糖偶联的钙敏感性染料（Fura-2）。我们通过将染料注射到蘑菇体神经元的轴突或胞体区域，实现逆行标记。本方法着重降低侵入性，以确保蜜蜂仍可用于基于伸吻反射（PER）的条件化训练。我们通过记录控制伸吻反射的肌肉（M17）的肌电图，实现对行为反应的监测与量化2。
生理实验后，利用共聚焦扫描显微镜对成像结构进行更详细的观察，以确定神经元的身份。
方案
蜜蜂准备与回填
- 在蜂巢处捕捉蜜蜂采集蜂，并用冰块冷藏使其 immobilization（固定）。
- 将蜜蜂固定于 Plexiglas 记录室3中，用低熔点硬蜡将复眼和胸部固定在记录室壁上。
- 使用常规电生理实验所用的玻璃毛细管，将其拉制后在尖端折断，使尖端直径约为 10μm。用染料糊覆盖毛细管尖端，染料糊由 Fura-2 dextran 与可固定赖氨酸的四甲基罗丹明葡聚糖按 10:1 比例混合而成。
- 染色过程中，用微量操作针或正二十烷固定触角；移除脑上方的一小片体壁，将腺体和气管移向一侧，以暴露蘑菇体区域。
- 将毛细管插入蘑菇体神经元的胞体或轴突区域，可手动操作或使用显微操作器完成。随后将体壁碎片复位，并松开触角。
- 在将蜜蜂置于 20°C 的湿润环境中孵育至少 4 小时或过夜前，喂食 30% 蔗糖溶液。
活体成像
- 使用一小块海绵压住蜜蜂的腹部，并用夹子或胶带将其固定在记录室中，以防止蜜蜂移动。
- 为防止食道搏动引起脑部移动，可在上唇上方的体壁上切一小切口，小心地将食道及其周围固态结构拉出，使其处于张力状态但不损伤食道4。随后用双组分硅胶覆盖。
- 用针刺出小孔，并插入导线电极以记录M17神经元活动。
- 去除脑部上方的体壁、气管和腺体组织。用一小片纸....
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讨论
在本演示中，我们已逐步介绍了开展研究所需的全部步骤 体内 蜜蜂中的钙信号。我们将该技术应用于蘑菇体神经元，但只要建立相应的染色方法，该成像技术也可用于所有类型的神经元。本研究重点关注蜜蜂嗅觉通路中的神经元。所有实验均在暗室中进行，实验装置采用长波长光源照明，该光源处于蜜蜂视觉感知范围之外，且不会激发所使用的染料。必须避免任何可能的荧光伪影，例如硅胶中的气泡。
该系统的主要优势之一是能够以空间和时间分辨率采集神经元活动的相关信息。同时，我们还可以在蜜蜂表现出相关行为时进行观察，例如在研究与学习相关的神经可塑性时。然而，其空间和时间分辨率仍存在一定的局限性。in vivo 钙成像实验的时间受到限制。与细胞外电生理记录方法（可持续数小时甚至数天）不同，我们的实验时间大约仅限于90分钟。当以5 Hz的采样率、采用两种激发波长进行85次测量时，每次测量持续10秒，340 nm曝光时间为20 ms，380 nm曝光时间为5 ms，信号质量仍然较为理想。此后，荧光染料漂白可能成为问题。
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致谢
本工作由德国研究基金会（DFG）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低熔点硬蜡 Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 葡聚糖钾盐，分子量 10 000 | Invitrogen | F-3029 | 避光保存。 |
| 四甲基罗丹明葡聚糖，分子量 10 000 | Invitrogen | D-3312 | 避光保存。 |
| 正二十烷（n-eicosane） | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil 粘合剂 | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| 成像系统 | TILL Photonics | ||
| CCD 相机 | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
参考文献
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings....
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