在体 Ca2+ 成像观察蜜蜂嗅觉学习过程中蘑菇体神经元的活动

摘要

蜜蜂可通过 appetitive 嗅觉学习范式（PER-conditioning）进行条件化训练。利用气味作为刺激，我们建立了一种方法，在记录行为的同时，结合钙成像技术检测蘑菇体神经元中由气味诱发的神经活动。 体内.

摘要

本实验室十余年前由 Joerges、Küttner 和 Galizia 建立了用于钙成像的 in vivo 和 semi-in vivo 制备方法，以检测触角叶中由气味诱发的神经活动¹。此后，该方法被持续优化，并应用于蜜蜂脑中的不同神经节。本文描述了目前实验室用于检测蘑菇体神经元活性的制备方法，采用与葡聚糖偶联的钙敏感性染料（Fura-2）。我们通过将染料注射到蘑菇体神经元的轴突或胞体区域，实现逆行标记。本方法着重降低侵入性，以确保蜜蜂仍可用于基于伸吻反射（PER）的条件化训练。我们通过记录控制伸吻反射的肌肉（M17）的肌电图，实现对行为反应的监测与量化²。

生理实验后，利用共聚焦扫描显微镜对成像结构进行更详细的观察，以确定神经元的身份。

方案

蜜蜂准备与回填

1. 在蜂巢处捕捉蜜蜂采集蜂，并用冰块冷藏使其 immobilization（固定）。
2. 将蜜蜂固定于 Plexiglas 记录室³中，用低熔点硬蜡将复眼和胸部固定在记录室壁上。
3. 使用常规电生理实验所用的玻璃毛细管，将其拉制后在尖端折断，使尖端直径约为 10μm。用染料糊覆盖毛细管尖端，染料糊由 Fura-2 dextran 与可固定赖氨酸的四甲基罗丹明葡聚糖按 10:1 比例混合而成。
4. 染色过程中，用微量操作针或正二十烷固定触角；移除脑上方的一小片体壁，将腺体和气管移向一侧，以暴露蘑菇体区域。
5. 将毛细管插入蘑菇体神经元的胞体或轴突区域，可手动操作或使用显微操作器完成。随后将体壁碎片复位，并松开触角。
6. 在将蜜蜂置于 20°C 的湿润环境中孵育至少 4 小时或过夜前，喂食 30% 蔗糖溶液。

活体成像

1. 使用一小块海绵压住蜜蜂的腹部，并用夹子或胶带将其固定在记录室中，以防止蜜蜂移动。
2. 为防止食道搏动引起脑部移动，可在上唇上方的体壁上切一小切口，小心地将食道及其周围固态结构拉出，使其处于张力状态但不损伤食道⁴。随后用双组分硅胶覆盖。
3. 用针刺出小孔，并插入导线电极以记录M17神经元活动。
4. 去除脑部上方的体壁、气管和腺体组织。用一小片纸吸除头壳内的血淋巴。
5. 用双组分硅胶填充头壳，确保脑组织被完全覆盖。
6. 将蜜蜂置于显微镜载物台上，在硅胶表面滴加一滴水，使显微镜的浸水物镜浸入液滴中。聚焦于已染色的神经元。

气味刺激与信号记录

嗅觉仪：我们使用一种由计算机控制、自行搭建的刺激装置，即“嗅觉仪”，其设计如 Galizia 和 Vetter³ 之前所述。气味被稀释后送入持续的气流中，并定向吹向触角。任何刺激均由持续3秒、体积为0.2 mL的气味饱和空气脉冲组成。刺激程序可在记录软件 TILLVision 中设置。
显微镜与成像系统：我们使用蔡司荧光显微镜。通过安装在显微镜上的TILL-Photonics成像设备，在25°C下以5 Hz的采样率进行图像采集。钙信号通过X60、0.9 W的奥林巴斯浸水物镜和Imago CCD相机（640×480像素，芯片上4倍二值化合并为160×120像素）记录。使用340 nm和380 nm单色光激发Fura-2，进行比率测量。荧光信号经410 nm二向色镜和440 nm长通滤光片检测。记录参数在记录软件中设定。每次测量持续10秒，两种波长的曝光时间可根据每份样本的染色强度进行调整。
M17记录：通过细胞外记录唇部缩肌（M17）以监测与学习相关的行为反应，即 PER^5,6。将铜丝电极插入靠近口器的肌肉中，接地电极插入复眼。肌肉电位通过自行搭建的前置放大器放大，经数字化后存储于计算机中。刺激开始由嗅觉仪触发。

数据分析

1. 实验过程中：钙信号的记录数据被输入计算机并存储。记录软件 TILLVision 可对信号进行初步分析，例如计算不同波长（340nm/380nm）之间的比值，以及计算 deltaF（减去基线信号）。
2. 图像处理使用 IDL 编写的自定义程序完成。对每个像素点，计算来自 340nm 和 380nm 测量的 Ca²⁺ 信号比值。通过在刺激前的帧中取平均值确定背景荧光（F），并从比值信号中减去该背景值（deltaF）。
3. 定义感兴趣区域（ROI）：计算刺激期间各帧的平均值，并应用低通滤波（3×3 像素）。将灰度图像转换为伪彩色图像。在伪彩色图像中识别神经结构中的活性区域作为活性斑点，并将其定义为 ROI。
4. 通过在所有帧中对 ROI 内的像素取平均值（不进行任何滤波或校正），计算活性区域的时间动态变化。

形态学分析与重建

我们使用可固定的染料罗丹明葡聚糖（“mini ruby”）与 Fura-2 葡聚糖共同填充神经元。两种染料的分子量相同，应在神经元内共定位。宽场成像的空间分辨率非常有限，因此建议在实验后使用共聚焦扫描显微镜观察染色结构。

1. 生理学测量后，解剖脑组织并进行固定。
2. 用 PBS 冲洗，再用乙醇逐步脱水，并在水杨酸甲酯中透明处理。
3. 为进行共聚焦显微镜观察，将脑组织包埋于水杨酸甲酯中。
4. 我们使用 Leica TCS SP2 显微镜，激发波长为 543 nm。
5. 使用干镜或油镜扫描脑组织，并将染色结构与成像数据进行比较。

代表性结果：

如果染色和制备成功，在蘑菇体α叶的外在神经元中，假彩色标度下的信号可能如图1所示。
行为反应（PER）可通过刺激期间的脉冲频率减去刺激前的脉冲频率来计算（图2）。
可使用共聚焦显微镜对染色的结构进行更详细的观察（图3）。

图1： 钙成像信号的代表性结果（以庚醛进行刺激）。A：蜜蜂脑部的成像区域。B：通过20倍浸入式物镜在380 nm激发波长下观察到的原始荧光图像，蘑菇体的α叶以紫色轮廓标出。染料被注射至α叶腹外侧边缘，以标记外在神经元。C：在三秒刺激期间，由平均信号deltaF（340/380）生成的伪彩色图像；α叶以紫色标出，选定的兴趣区域（ROI）以黑色标出。D：对气味刺激响应的钙信号时间动态变化，信号来自C图中标示的兴趣区域的平均值。E：对蔗糖刺激同侧与对侧触角响应的钙信号时间动态变化，兴趣区域同C图所示。

图 2： 典型的 M17 反应。嗅觉条件化后，当气味在无奖励的情况下呈现时，蜜蜂会伸出口器。红线表示气味刺激。插图：蜜蜂的口器伸展反应（PER）。

图3： 代表性图像堆栈。成像实验后，解剖脑组织。使用20倍油镜物镜的共聚焦显微镜扫描图1中的神经元，紫色轮廓标出α叶。

讨论

在本演示中，我们已逐步介绍了开展研究所需的全部步骤 体内 蜜蜂中的钙信号。我们将该技术应用于蘑菇体神经元，但只要建立相应的染色方法，该成像技术也可用于所有类型的神经元。本研究重点关注蜜蜂嗅觉通路中的神经元。所有实验均在暗室中进行，实验装置采用长波长光源照明，该光源处于蜜蜂视觉感知范围之外，且不会激发所使用的染料。必须避免任何可能的荧光伪影，例如硅胶中的气泡。

该系统的主要优势之一是能够以空间和时间分辨率采集神经元活动的相关信息。同时，我们还可以在蜜蜂表现出相关行为时进行观察，例如在研究与学习相关的神经可塑性时。然而，其空间和时间分辨率仍存在一定的局限性。in vivo 钙成像实验的时间受到限制。与细胞外电生理记录方法（可持续数小时甚至数天）不同，我们的实验时间大约仅限于90分钟。当以5 Hz的采样率、采用两种激发波长进行85次测量时，每次测量持续10秒，340 nm曝光时间为20 ms，380 nm曝光时间为5 ms，信号质量仍然较为理想。此后，荧光染料漂白可能成为问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低熔点硬蜡 Deiberit 502	Dr. Böhme Schöps Dental GmbH
FURA-2 葡聚糖钾盐，分子量 10 000	Invitrogen	F-3029	避光保存。
四甲基罗丹明葡聚糖，分子量 10 000	Invitrogen	D-3312	避光保存。
正二十烷（n-eicosane）	Sigma-Aldrich	21, 927-4
Kwik Sil 粘合剂	World Precision Instruments, Inc.	KWIK SIL
成像系统	TILL Photonics
CCD 相机	Imago
CED	Texas Instruments