本方案描述了在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）合胞体胚胎中利用显微注射和高分辨率成像技术研究有丝分裂的方法。
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摘要
摘要
本方案描述了以下方法的使用 黑腹果蝇 用于研究有丝分裂的合胞体胚胎1. 果蝇 具有丰富的遗传学资源和已测序的基因组，易于培养和操作。存在大量有丝分裂突变体，且已有并正在持续构建表达功能性荧光标记（如GFP）有丝分裂蛋白的转基因果蝇。利用GAL4/UAS系统可实现基因的靶向表达。2.
的 果蝇 早期胚胎以极快速度进行多次有丝分裂（细胞周期持续时间， ≈10 分钟）。该系统非常适合用于有丝分裂成像，因为在第10至13个周期中，细胞核在胚胎表面皮层下方的单层内快速且同步地分裂，期间不发生胞质分裂。这些快速分裂的细胞核可能使用与其他细胞相同的有丝分裂机制，但其结构更优化以实现高速分裂；通常认为其检查点机制并不严格，因此可用于研究那些在检查点严格的细胞中缺失时会导致细胞周期阻滞的有丝分裂蛋白。表达GFP标记蛋白或显微注射荧光标记蛋白的胚胎可轻松进行活体成像，以追踪动态过程（图1）。此外，还可向胚胎显微注射功能阻断型抗体或特定蛋白的抑制剂，以研究其功能丧失或扰动所产生的效应3这些试剂可在胚胎内扩散，作用于多个纺锤体，形成抑制剂浓度梯度，从而产生类似于等位基因系列突变体的缺陷梯度。理想情况下，若目标蛋白带有荧光标记，则可直接观察到抑制作用的梯度分布。4通常认为最强的表型与无效表型相当，尽管很难完全排除抗体在极少数情况下可能具有显性效应，因此必须设置严格的对照并谨慎解释结果。在距离注射位点较远的区域，蛋白质功能仅部分丧失，从而使靶蛋白的其他功能得以显现。
方案
配方：
葡萄汁平板：
- 5.5 g 细菌琼脂
- 14.5 g 葡萄糖
- 7.15 g 蔗糖
- 45 ml 葡萄汁浓缩液（100% 果汁）。
- 204.5 ml H20
- 625 μl 10N NaOH
混合所有成分，微波加热至沸腾。
加入 2.8 ml 酸混合液（酸混合液：20.9 ml 丙酸，2.1 ml 磷酸，27 ml H2O）
混合后倒入35 mm的培养皿中。在室温下静置一至两天使其凝固。若培养皿暂时不使用，可用封口膜密封后置于4°C保存（使用前需恢复至室温）。
酵母膏：
取约一茶匙酵母（Sigma YSC2，酿酒酵母II型）溶于水中，制成浓稠糊状。使用前，将少量该糊状物置于每块葡萄汁平板上。
G-PEM缓冲液：
- 80 mM Na-PIPES，pH 6.9
- 1 mM MgCl2
- 1 mM EGTA
- 1 mM GTP
注射缓冲液：
- 150 mM K-Aspartate
- 10 mM K-phosphate
- 20 mM 咪唑，pH 7.2
庚烷胶：
展开双面胶带，放入100 ml的瓶子中，加入约50 ml庚烷，密封瓶口，摇晃数天。使用时，若胶液过稠，可加入庚烷稀释。
脱水室：
取一个100 mm的培养皿，将一个35 mm培养皿的一部分放入其中作为“台面”，并在周围加入干燥剂（无水硫酸钙），使干燥剂的高度不超过“台面”和盖子。带有胚胎的盖玻片将在注射前放置于此“台面”上进行脱水处理。建议至少使用部分指示型干燥剂，并在其变色后及时更换。
方案：
该方案可用于将几乎任何可溶性试剂注射到果蝇合胞体胚胎中：例如，可用于观察的荧光蛋白，或靶蛋白抑制剂，或两者同时注射。
做好所有准备工作：
1. 实验前 2 至 3 天，制备葡萄汁培养基平板并设置产卵笼：取一个塑料瓶（6 oz，来自 Applied Scientific Drosophila 的圆底瓶），在瓶体相对两侧各剪一个约 1 cm2 的小孔，并塞入棉团（以允许空气流通），将果蝇轻轻敲入瓶中，然后盖上葡萄汁培养基平板。置于 25°C（或室温）培养，果蝇可产卵约 10 天。
2. - 实验至少前一天制备注射用针头，我们使用 Kopf 针头/移液管拉制仪型号 720 和薄壁玻璃毛细管（World Precision Instruments tw100f）。对于荧光标记微管蛋白的注射，需将针头保存在 4°C，以防止针头内因温度升高引发微管蛋白聚合。
微管蛋白制备：
注意：所有与微管蛋白相关的操作均应在 4°C 下进行，以防止其发生聚合。
- 从冷冻箱中取出标记的微管蛋白，置于冰上解冻5至15分钟。
- 用G-PEM缓冲液稀释（根据所需强度稀释4至10倍）。
- 在4°C下以13,000 rpm离心10至15分钟。
- 向针头中加入1 - 2 μl样品。
抗体或化学抑制剂：
使用适当浓度的抗体（可能需要预先测试）制备针头，方法与制备微管蛋白针头相同。抗体可溶于注射缓冲液、G-PEM缓冲液或PBS中。如果需要使用其他缓冲液，则必须将该缓冲液作为对照进行注射，以确保该缓冲液本身不会造成任何损伤。
注意：如果浓度允许，可将抑制剂与荧光标记微管蛋白混合后共同注射。否则，应先注射荧光标记微管蛋白，等待5至10分钟后，再注射抑制剂。进行双重注射时，应起始使用更多的胚胎，因为正常恢复的胚胎数量会较少。
胚胎收集：
- 将一块新的葡萄汁培养基平板放入产卵笼中。
- 一小时后移除该平板，这是当天的第一次收集，通常质量较差，可予以丢弃。
- 每小时更换一次平板，持续收集胚胎，每次收集一小时。
盖玻片准备：
- 将一个 50 x 22 mm 的盖玻片放置在载玻片的一侧。用胶带将盖玻片的四个角固定在载玻片上，防止其移动。
- 使用棉签，在盖玻片上沿一条线均匀涂布一层正庚烷胶水（胶水不应过于黏稠，且应在几秒内干燥；若未达到此状态，可加入更多正庚烷调节）。
- 在载玻片上靠近盖玻片的一侧贴上一段双面胶带。
胚胎准备：
注意：应在开始收集后约2小时对胚胎进行成像，因此请安排充足时间，确保在该时间范围内完成以下步骤。
- 用湿润的毛笔小心地从葡萄汁培养基上拾取胚胎，并将其放置在载玻片的双面胶带上。
- 使用镊子的外侧部分，在双面胶带上滚动胚胎，直至其卵壳（外层膜）破裂打开。
- 轻轻滚动胚胎使其附着在卵壳上，然后用镊子夹起胚胎，将其长轴与盖玻片长边平行地放置在盖玻片的庚烷胶上。每行排列10至20个胚胎。
- 取下盖玻片，放入脱水室中脱水3至8分钟（时间长短取决于室内湿度及待注射样本数量）。
- 将盖玻片置于涂有真空脂的金属腔室上。
- 用卤代烷油700覆盖胚胎，以防止进一步脱水。此时胚胎已准备好进行显微注射。
胚胎注射：
- 在 16 倍物镜下找到胚胎。
- 将胚胎移开，并在不改变焦平面的情况下找到显微注射针。
- 将显微注射针置于视野中央，并在不沿 x 或 y 方向移动的情况下将其向上移动。
- 如果显微注射针未打开，将盖玻片的边缘置于视野内（但不要遮挡显微注射针的位置），然后将显微注射针降至同一焦平面。非常小心地移动盖玻片，直到其接触显微注射针并轻轻将其打开。如果显微注射针已打开，则进入步骤 5。（显微注射针可在填充前用氢氟酸处理打开）。
- 将胚胎移入视野（但不要置于显微注射针下方），将显微注射针插入油中，并确保从针尖形成良好的液滴。
- 小心而稳定地将胚胎移向显微注射针，向胚胎内注入一滴液体，然后将胚胎移开。（或按照您所使用的显微注射装置的说明进行操作）。
- 完成所有胚胎的注射后，即可用于共聚焦显微镜观察。
成像：
使用配备60或100倍物镜的共聚焦显微镜对胚胎进行成像：
注意事项：
- 由于胚胎中的有丝分裂过程非常迅速，具体时间间隔取决于所研究的精确过程，延时成像系列的时间间隔应至多为几秒钟。
- 可根据所关注的过程选择采集三维序列或单个层面图像。
- 对于作用迅速的抑制剂，需快速将样品从注射显微镜转移至成像显微镜。
图1： 有丝分裂研究 果蝇 合胞体胚胎。早期胚胎中的细胞核进行快速分裂而不发生胞质分裂，在第10至13个周期期间，细胞核在皮层形成单层排列。 A早期胚胎中细胞核位于皮层的示意图。该胚胎可表达GFP和/或RFP标记的蛋白质，并可通过显微注射引入其他标记蛋白质和/或抑制剂。 B. 表达GFP-微管蛋白和RFP-组蛋白的胚胎的延时成像 C. 野生型胚胎中第11、12和13个周期的两极间距变化图。纺锤体长度表现出等长期和伸长期的交替，具有高度一致性和可重复性。 D. 纺锤体微管的动力学。注射低浓度的罗丹明标记微管蛋白可形成由少数微管蛋白亚基组成的斑点，可用于研究微管动力学。
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讨论
该实验方案相对简单，但每一步均需经过练习，以确保胚胎不受损伤。必须始终进行严谨的对照实验，以保证获得可靠的结果。一种良好的起始方法是：向表达GFP-微管蛋白的对照胚胎中显微注射缓冲液或罗丹明标记的微管蛋白，以确认有丝分裂在胚胎表面的所有周期（第10至第13周期）中均正常进行。在对照胚胎中，不应观察到纺锤体之间存在任何物理连接，此类连接通常是脱水过度所致，因此应缩短脱水时间。当胚胎受损时，常可观察到核物质脱落、游离的中心体或细胞核及纺锤体分布不均等现象。极-极距离的绘图结果具有高度可重复性，是衡量“成功”的可靠指标；在对照胚胎中，其图形应与图1所示一致。
我们已采用该方案，利用针对目标蛋白的单克隆抗体、多肽抗体或多种多克隆抗体，研究纺锤体组装、维持及伸长的多个方面1,5,6,7,8,9,10,11,12,13。也可显微注射特异性蛋白抑制剂或其他影响目标蛋白的化学物质，并观察其效应，进行定量测量。为评估特定抑制剂的作用，我们将抑制处理后的纺锤体长度与对照组胚胎中的纺锤体长度进行比较。此外，通过显微注射低浓度荧光标记的微管蛋白，结合荧光斑点显微技术14<...
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致谢
本方案目前在我们的实验室中使用，并多年来由包括David Sharp博士、Mijung Kwon博士、Patrizia Sommi博士和Dhanya Cheerambathur博士在内的多位研究人员不断优化。我们感谢Bill Sullivan博士（加州大学圣克鲁兹分校，UCSC）在我们刚开始开展该体系研究时，就早期Drosophila胚胎的操作与显微注射提供了宝贵建议（参考文献13）。我们感谢Scholey实验室的所有成员。本研究中关于Drosophila有丝分裂的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目GM55507支持。
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参考文献
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