本文描述了利用从季节性缺氧峡湾垂直深度连续样品中分离的环境基因组DNA构建fosmid文库的方法。通过自动化菌落挑取系统，将构建的克隆文库挑取至384孔板中，以便后续测序和功能筛选，并进行存档保存。
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本文内容
摘要
摘要
自然界中绝大多数微生物目前仍无法通过传统的培养方法获得。在过去十年中，不依赖培养的环境基因组学（i.e.宏基因组）方法应运而生，使研究人员能够通过直接从环境中捕获土著微生物群落的遗传物质，从而填补这一培养空白。为此，通常采用标准但技术要求较高的实验室克隆技术构建基因组DNA文库。本文描述了一种利用来自季节性缺氧峡湾垂直深度连续水体的DNA构建大插入片段环境基因组fosmid文库的方法。本实验方案与一系列相关联的实验方案直接衔接，包括近海海水采样[1]、微生物生物量的大体积过滤[2]以及DNA提取与纯化方案[3]。首先，高质量的基因组DNA经过末端修复，形成5'-磷酸化的平末端。经末端修复的DNA通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行片段大小筛选，并通过凝胶回收技术提取长度在30至60千碱基对（Kb）之间的DNA片段。筛选后的DNA片段从PFGE凝胶基质中纯化，并连接至经磷酸酶处理的平末端fosmid CopyControl载体pCC1（EPICENTREhttp://www.epibio.com/item.asp?ID=385). pCC1 和插入 DNA 的线性串联体随后通过 λ 末端酶进行完全包装，进入噬菌体颗粒，并进一步感染噬菌体抗性菌株E. coli细胞。在抗生素筛选条件下，成功转导的克隆将被回收至LB琼脂平板上，并使用自动化菌落挑取机器人（Qpix2, GENETIX）以384孔板格式进行存档。本实验方案综合了多种来源，包括EPICENTRE公司的CopyControl Fosmid文库构建试剂盒以及多个研究团队已发表的研究成果[4-7]。每一步操作均以最佳实践为指导原则。在可能的情况下，我们特别指出了操作中的细微要点，以提高文库构建的整体质量与效率。整个Fosmid文库构建及自动化菌落挑取过程至少需要7至10天，因其中包含多个孵育步骤。然而，本方案中也指出了若干可暂停操作的节点。
方案
fosmid文库构建分为四个主要步骤，并进一步细分为多个部分（总体流程见图1）。
步骤 I（参见方案“从 0.22 μM Sterivex 滤膜中提取 DNA”[3]）
第一部分：酶催化细胞裂解
第二部分：通过氯化铯密度梯度离心纯化环境DNA及DNA回收
第3部分：通过凝胶电泳对提取的DNA进行质量控制
第二步
第1部分：回收环境DNA的酶法修饰步骤
环境DNA末端修复步骤所需的所有试剂均包含在EPICENTRE公司的pCC1 Fosmid文库构建试剂盒中。理想情况下，基因组DNA的浓度应调整至0.5 μg/μl。
- 将所有试剂在冰上解冻，混合以下组分，并短暂离心以使所有液体沉至管底：
- x μl 无菌水
- 8 μl 10X 末端修复缓冲液
- 8 μl 2.5 mM dNTP 混合物
- 8 μl 10 mM ATP
- 最多 20 μg 剪切后的插入 DNA（约 0.5 μg/μl）
- 4 μl 末端修复酶混合物
- 总体积 80 μl
- 室温孵育至少 45 分钟，最长至 60 分钟，随后在 70°C 加热 10 分钟以灭活酶混合物（在此期间，准备低熔点琼脂糖凝胶用于后续对末端修复后的 DNA 进行大小选择，见下文）。
第二部分：通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）对基因组DNA进行大小筛选
- 将1.5 g低熔点琼脂糖重新悬浮于150 mL 1.0X TAE电泳缓冲液中，并加入一个小磁力搅拌子。用可微波加热的塑料膜封口烧瓶，在微波炉中快速煮沸，直至琼脂糖完全溶解。持续搅拌溶液，直至冷却至可倒入凝胶托盘的温度（约60°C）。
注意：切勿在凝胶或电泳缓冲液中加入溴化乙锭或SYBR Gold。 - 组装凝胶托盘以制备凝胶，并选择一个合适的梳子，确保能够为完整的末端修复混合物提供足够的空间，以便将其加载到一个或两个孔中（80 μl加上适量上样缓冲液）。
- 向电泳槽中加入2.2 L 1.0X TAE缓冲液，开启设备以循环运行缓冲液，并将冷却装置设定为14°C。泵的转速应保持在70 rpm，以确保运行缓冲液充分循环并维持缓冲液温度在14°C。
- 当熔化的琼脂糖冷却后，将其倒在水平的凝胶托盘上，注意避免产生气泡。确保熔化的琼脂糖在梳齿周围分布均匀，否则应取出梳子并重新插入熔化的琼脂糖中。待凝胶完全凝固后，移除梳子，并在凝胶的第四个孔中加入MidRange I PFG标准品。从凝胶注射器中挤出琼脂糖，并用解剖刀在末端切下一小块凝胶塞。将凝胶塞置于孔的前端，并用熔化的琼脂糖密封。将凝胶放入电泳槽中。
注意：操作琼脂糖凝胶时务必格外小心，因为低熔点凝胶容易破裂。在开始上样前，请确认运行缓冲液已冷却至14°C。如果发现孔被琼脂糖堵塞，下次可尝试以下方法：在从凝胶中取出梳子前，向梳子周围加入1–2 mL TAE缓冲液；这样可以获得更清晰的加样孔。 - 在第一个孔中加入5 μl λ HindIII酶切产物，随后加入1 μl的fosmid对照大小标准品（EPICENTRE，100 ng/μl）。在微量离心管中向大小标准品中加入10 μl无菌水以及适量上样缓冲液。较大的体积有助于更方便地上样。紧邻fosmid标准品的孔中，加入经末端修复和热失活处理的混合物，并添加适量上样缓冲液。盖上盖子并设置程序。
注意：我们强烈建议加载不同量的其他DNA ladder，以粗略定量DNA量或观察基因组DNA的剪切程度。理想的标准品包括λ DNA-HindIII Digest和MidRange I PFG Marker（均来自NEB）。 - 设置程序参数：若您的PFGE系统具备自动算法功能，请使用该功能。程序将自动计算分离特定大小范围DNA所需的设置。所用参数如下：DNA大小范围2–250 Kb；校准因子：1；电场梯度：[6 V/cm]；运行时间：12:00小时；夹角：120°；初始切换时间：0.1秒；最终切换时间：21.79秒；递增速率a = 线性。
- 为观察DNA，将250 mL 1.0X TAE缓冲液倒入容器中，并加入25 μl 10,000X SYBR Gold；在将凝胶放入溶液前轻轻混匀。由于SYBR Gold对光敏感，需在避光条件下染色1小时。
注意：操作琼脂糖凝胶时务必格外小心，因为低熔点凝胶容易破裂。
第三部分：通过凝胶回收提取DNA，并将回收的DNA连接至fosmid克隆载体
本部分所需的所有试剂均包含在 EPICENTRE 菲士midt文库构建试剂盒中。
- 同时准备一个 70°C 的水浴和一个 45°C 的水浴，用于后续的凝胶消化步骤。
- 将染色后的凝胶、一个已去皮重的微量离心管和一把无菌手术刀带到蓝光透射仪旁。在蓝光下观察末端修复后的基因组 DNA 和fosmid对照大小标记物。用手术刀切取与fosmid对照大小标记物迁移位置相同或略高的凝胶条带（切取约 5–7 mm 宽的凝胶片），并将该凝胶片转移至已去皮重的微量离心管中。在凝胶上同时跑一个 MidRange I PFG Marker，有助于避免切胶位置过高。
注意：在将凝胶放置于蓝光透射仪前，先在其表面覆盖一层塑料膜，以防止交叉污染；开启蓝光前请佩戴防护眼镜。切勿切取基因组 DNA 迁移位置低于 fosmid 对照大小标记物的凝胶条带，否则会导致产生不需要的嵌合克隆。
可以切取并保存含有较低或较高分子量 DNA 的凝胶片，分别用于构建全基因组鸟枪法文库或 BAC 文库。
暂停点 I：回收的凝胶片可在 -20°C 下保存长达一年 - 称量已去皮重的离心管，计算凝胶片的重量。每 1 mg 琼脂糖大约可产生 1 μl 熔化的琼脂糖。
- 将含有基因组 DNA 的低熔点琼脂糖在 70°C 水浴中融化 10–15 分钟（我们不添加 gelase 缓冲液）。待凝胶完全融化后，迅速将离心管转移至 45°C 水浴中。
注意：不要通过涡旋来促进溶解，以免剪切 DNA。 - 每 100 μl 熔化的琼脂糖中加入 1 U（1 μl）GELase 酶制剂。在 45°C 下孵育 1 小时，然后加入更多 GELase（2–4 μl），再继续孵育 1 小时。随后在 70°C 下加热 10 分钟以灭活 GELase 酶制剂。
将离心管置于冰上 10 分钟，然后在最大转速（13,000 rpm）下离心 15 分钟，以沉淀任何不溶性颗粒。小心移除上清液并转移至一个 15 mL Falcon 管中，向该管中加入 3 mL 无菌水。
注意：避免吸取沉淀的琼脂糖。由于我们使用的 GELase 量超过试剂盒提供的量，因此需单独订购额外的 GELase 酶制剂。 - 将溶液转移至 Amicon Ultra-4 离心过滤装置（Ultracel-10 膜），在 4,000 g 下离心 6–8 分钟，弃去滤过液。持续离心至滤膜上剩余溶液体积约为 100 ~ 500 μl。向之前使用的空 Falcon 管中再加入 3 mL 无菌水，将溶液重新转移至 Amicon 装置中，并重复离心步骤。再用 3 mL 水洗涤一次，再次弃去滤过液。最终将体积浓缩至 50–100 μl。
注意：我们使用摆桶转子进行离心；只需将 Amicon 离心过滤装置放入一个 50 mL Falcon 管中，即可在离心过程中固定其位置。即使经过长时间离心，Amicon 滤膜仍可安全保留至少 50 μl 溶液。 - 将 Amicon 管中剩余的 DNA 溶液转移至一个预先清洗过的 Microcon YM-50 离心过滤装置中，并用额外的 50 μl 无菌水冲洗 Amicon 管，以回收全部 DNA。在微量离心机中以 10,000 g 离心 Microcon YM-50 装置，直至滤膜表面仍轻微覆盖液体为止。每隔一分钟检查一次，当滤膜上仅剩少量液体时即停止。将滤膜倒置，放入一个新的微量离心管中，在 1,000 g 下再次离心 3 分钟以回收 DNA 溶液。最终回收体积不应超过 10–15 μl，否则可能导致连接反应中 DNA 浓度过低。
注意：切勿将滤膜离心至完全干燥。若膜已干燥，请加入 10–15 μl 水，轻轻振荡 30 秒，然后按上述方法回收 DNA。 - 使用 NanoDrop 或 PicoGreen 检测法对所得 DNA 溶液进行定量。
- 回收的末端修复 DNA 现已准备好与 pCC1-fosmid 克隆载体进行连接。将以下试剂在冰上解冻，并确保载体与插入片段的摩尔比为 10:1。
注意：0.5 μg pCC1-fosmid 载体 ≈ 0.09 pmol 载体。
0.25 μg 约 40 Kb 的插入 DNA ≈ 0.009 pmol 插入 DNA
若在将感染的 E. coli 细胞涂布于筛选平板后仅获得少量 fosmid 克隆，则可考虑增加连接反应中使用的 DNA 量。
按以下顺序加入试剂，短暂离心使所有液体沉至管底，轻弹管壁后再次离心：
- x μl 无菌水
- 1 μl 10X Fast-Link 连接缓冲液
- 1 μl 10 mM ATP
- 1 μl pCC1-fosmid 载体（0.5 μg/μl）
- x μl 浓缩的插入 DNA（0.25 μg）
- 1 μl Fast-Link DNA 连接酶
- 总体积 10 μl
- 室温孵育 2 小时，然后在 70°C 下加热 10 分钟以灭活酶。
暂停点 II：可将连接产物在 -20°C 下保存，或直接进入噬菌体包装步骤。
注意：单次连接反应可产生 103–106 个克隆，具体数量取决于环境 DNA 的质量。根据所需特定覆盖度估计所需的克隆数，可相应放大连接反应规模。若放大连接反应，则应按如下说明同比例增加噬菌体包装提取物的用量。
第三步
第1部分：载体-插入片段连接产物的噬菌体包装
- 在计划进行噬菌体包装的前两到三天，将提供的 EPI300-T1R 涂布菌株划线接种于普通 LB 平板上，37°C 过夜培养以获得单菌落。该平板可密封后于 4°C 保存，以备后续使用。
- 包装反应前一天，取步骤 1 中获得的单菌落接种至 50 mL 含 10 mM MgSO4（加入 500 μl 1 M MgSO4）的 LB 液体培养基中，37°C、225 rpm 振荡过夜培养。
- 进行包装反应当天，取 5 mL 步骤 2 中制备的过夜培养物接种至新鲜的 50 mL LB 液体培养基（含 10 mM MgSO4）中。 在 37°C 下培养至 OD600 达到 0.8 至 1.0，切勿超过 OD600 1.0！在分光光度计上测量前需稀释样品，以获得准确结果。细胞制备后应置于冰上或 4°C 保存，直至后续使用。
注意：暂停点 III：若有必要，培养物可在 4°C 保存最多 72 小时；但强烈建议使用新鲜培养的菌液。 - 将 MaxPlax Lambda 包装提取物置于冰上解冻，每进行一次连接反应需使用一管。解冻过程需 10–15 分钟。同时，将 1.5 mL 离心管置于冰上预冷。
注意：解冻后的噬菌体提取物不宜在冰上放置过久，否则噬菌体感染效率会下降。 - 解冻后应立即将每管包装提取物中的 25 μl 转移至另一预冷的 1.5 mL 微量离心管中，并放回冰上。 将剩余的包装提取物立即放回 -80°C 保存。
注意：切勿将包装提取物与干冰或其他任何 CO2 气源共同存放。 - 将 10 μl 连接反应产物加入冰上放置的每 25 μl 解冻提取物中。通过反复吹打混匀，避免引入气泡。 短暂离心使液体全部沉至管底，随后于 30°C 孵育 90 分钟进行包装反应。在孵育 80 分钟后，开始将剩余的包装提取物置于冰上解冻。
注意：30°C 孵育步骤建议使用水浴而非加热金属块。 - 90 分钟包装反应完成后，向每管反应体系中加入剩余的 25 μl 包装提取物。继续在 30°C 孵育 90 分钟。孵育结束后，向每个包装管中加入 100 μl 预先配制的噬菌体稀释缓冲液，并轻柔混匀。
注意：若最终转化效率较低，可能是由于噬菌体提取物过期或曾暴露于干冰或其他 CO2 气源。根据我们的经验，将包装反应在室温下进行（两次 90 分钟）而非 30°C，并在最后额外于 30°C 孵育 2 小时，可提高最终克隆数量。 - 向每管中加入 5 μl 氯仿，并轻柔混匀，使管内总体积达到 165 μl。加入氯仿后可能形成黏稠沉淀，但不会影响文库构建。然而在吸取噬菌体颗粒时，应避免吸取该沉淀物以及有机相氯仿层。
暂停点 IV：此时，包装完成的噬菌体颗粒可在 4°C 保存数天。
注意：为获得最佳的噬菌体感染效率，建议使用新鲜制备的噬菌体。
第2部分：文库宿主大肠杆菌（E. coli）的感染
- 将包装好的噬菌体以每 10 μl 噬菌体颗粒加入 400 μl EPI300-T1R 细胞的比例，添加至 EPI300-T1R 宿主细胞（OD600=0.8–1.0）中。为避免移液时带入氯仿，建议使用 125 μl 包装好的噬菌体颗粒与 5 mL 预先准备的 EPI300-T1R 宿主细胞。轻轻混匀后，于 37°C 培育 30 分钟。
注意：从噬菌体包装管中取出噬菌体颗粒时，注意不要将氯仿转移至宿主细胞中。若不确定，可减少包装噬菌体颗粒的取用量。
第3部分：铺板与滴度测定
- 在四个含有LB培养基和12.5 μg/mL氯霉素的小型培养皿中各加入5-7颗已灭菌的玻璃珠。
- 将噬菌体感染的EPI300-T1R细胞分别以50 μl重复两次、10 μl重复两次，接种到四个独立的平板上。为确保均匀涂布，在加入10 μl感染细胞的平板中额外加入少量LB液体培养基（约50 μl）。水平摇动平板使细胞均匀分布。室温静置15分钟使液体吸收，然后将平板倒置以去除玻璃珠。
注意：这些平板用于确定转化子数量，并计算在挑取克隆步骤中所需的适当稀释倍数，以避免菌落密度过高。 - 将平板倒置放入37°C培养箱中培养16至24小时，最长可至48小时，直至菌落形成。24小时后检查平板，防止生长较快的克隆蔓延至邻近菌落。
- 同时，将5 mL感染后剩余的细胞在4°C下以3,500 g离心10分钟进行收集。弃去上清液。向沉淀中加入1 mL LB/20%甘油溶液，重悬细胞沉淀，并将悬液分装至2 mL冻存管中，每管100 μl。立即冷冻，并于-80°C保存，以备后续克隆挑取步骤使用。
- 次日，计数平板上的克隆数并测定滴度。计算总fosmid克隆数时，务必计入正确的稀释倍数。
注意：该实验流程通常可获得总计10,000至50,000个fosmid克隆；然而，根据提取环境DNA的质量和纯度不同，克隆数范围可能在3,000至80,000之间。
第四步
第一部分：培养基平板和孔板的制备
- 按以下方式将培养基倒入培养皿中；每毫升 LB 培养基中加入 12.5 μg 氯霉素：
- 100×15 mm 培养皿：25 mL LB 琼脂
- 150×15 mm 培养皿：50 mL LB 琼脂
- 245×245 mm 方形生物测定板：250 mL LB 琼脂
- 将含有已制备fosmid克隆的甘油菌种在冰上解冻。根据计算出的滴度，取适量菌液涂布到所选培养皿上（制备甘油菌种时细胞浓度通常浓缩约5倍）。细胞培养的孵育时间为37°C下24小时。
暂停点V：当菌落形成后，将密封的琼脂平板在4°C下保存，最长可保存一个月，直至进行菌落挑取步骤。
注意：菌落应均匀分布，彼此之间保持足够距离，直径约为1 mm。使用玻璃珠涂布细胞可实现良好的菌落分离。在100×15 mm培养皿上，通常150~250个菌落是机器人挑取效率最高的密度；对于22×22 cm的培养皿，菌落数不应超过2,000个。 - 在进行菌落挑取当天，准备96孔或384孔板，每孔加入含12.5 μg/mL氯霉素的LB液体培养基，以及用于文库在-80°C保存的20%甘油。使用下文所述的自动化QFill3平板填充系统填充孔板。
- 对两套玻璃瓶（500 mL）、瓶盖和硅胶管进行高压灭菌。切勿对包括针头组件和安装法兰在内的分配器 manifold 进行高压灭菌。在本生灯火焰附近或生物安全柜内组装QFill3，以建立并维持无菌环境。
注意：确保将硅胶管插入夹管阀中，方法是按下夹管阀激活器，并将管子完全滑入阀门内（其作用类似于控制培养基向下一列分配的刹车）。 - 通过依次让约50 mL的1%次氯酸钠溶液、高压灭菌的dH2O和80%乙醇流过分配针，对其进行灭菌，并在平台上放置一个吸头盒盖以收集废液。灭菌完成后，更换为另一套包含玻璃瓶、瓶盖和硅胶管的装置。
- 在玻璃瓶中加入约300 mL培养基。运行足够量的培养基以彻底清除清洗步骤中残留的乙醇。待管路清洗完毕后，将96孔或384孔板放置于平台上。按下“开始”按钮填充孔板；每个孔应加入200 μL制备好的LB液体培养基。为清洁分配针，需让约50 mL的80%乙醇流过系统。
注意：在填充前务必标记好孔板。
第二部分：菌落挑取机器人设置
- 我们正在根据用户手册使用克隆挑取机器人QPix2。用户应熟悉其机器人的操作方法，并了解如何设置各项参数，以确保最高的挑取效率。
- 为在克隆挑取区域周围创建无菌环境，请打开紫外灯照射30分钟。在紫外灯开启期间，准备500 mL的1%次氯酸钠溶液、500 mL无菌去离子水（dH2O）和500 mL 80%乙醇。当紫外灯关闭后，按照标签将溶液倒入相应的托盘中。始终将溶液倒入正确标记的溶液托盘中。从后到前依次倒入1%次氯酸钠溶液、高压灭菌的dH2O，最前面的托盘倒入80%乙醇。确保各托盘装满，若清洗液不足，挑针将无法被充分清洗。
注意：请持续监测80%乙醇的量，因其会挥发，需及时补充。 - 在设置好最佳挑取参数后，将含有fosmid克隆的预制琼脂平板和孔板放置于QPix工作区的定位柱之间。请确保已取下所有平板盖！
- 平板应紧贴右前角，以防止在挑取过程中发生移动。然后关闭前面板。
注意：此步骤极为重要！ - 当所有参数设置完成后，即可开始挑取程序。挑取完成后，用去离子水冲洗毛刷和托盘，并将其置于实验台上晾干。清理任何可能发生的溢洒，并用80%乙醇擦拭QPix内部。
第三部分：过夜孵育与文库保存
- 确保所有甘油菌种保存板均已标记标签，并将其放入 37°C 培养箱中培养 24 小时。在培养箱上留下备注，注明日期、培养的板数、培养时间、取出时间以及您的姓名首字母。
- 如需长期保存，将过夜培养的菌种放入 -80°C 冰箱中储存。
代表性结果：
本方案描述了构建环境宏基因组文库的步骤，用于捕获特定生境中微生物群落的遗传物质。该方案旨在构建一个能够代表所采样环境遗传内容的宏基因组文库，并在最终获得的宏基因组克隆数量过少时，指导读者对关键步骤进行修改和优化。
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讨论
本文描述了一种从海岸水样中提取基因组DNA并高效构建大片段插入型fosmid文库的实验方法。上游的基因组DNA提取步骤已在另一份实验方案中详细说明[3]。
由于fosmid文库的构建是一个多步骤的过程，建议至少提前两到三周规划整个实验流程，包括文中所述的四个步骤。基因组DNA的提取是最关键的一步，后续所有步骤都依赖于所提取基因组DNA的质量和数量，因此应为该步骤预留充足的时间并谨慎操作。对提取的DNA进行质量和数量的检测至关重要。在构建文库时，克隆数量偏低的情况时有发生，尤其是初次构建文库时。尽管fosmid文库的构建过程本身较为直接，但实验失败的主要原因通常在于提取和纯化的基因组DNA质量或数量不足。如果文库构建未成功，建议重新提取基因组DNA，并特别注意纯化和DNA回收过程中的各个步骤。
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致谢
我们感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）对近海和开阔大洋水体低氧区域持续研究的支持。M.T. 和 S.L. 获得了由TULA基金会资助的微生物多样性与进化中心（CMDE）提供的博士后奖学金支持。M.T. 还获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）的奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 第二步 | |||
| CopyControl™ Fosmid 文库构建试剂盒 | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | 足够用于构建 9–10 个 fosmid 文库 |
| SeaPlaque 琼脂糖 | Cambrex | 50100 | |
| 搅拌加热板 | Corning | PC-420D | |
| 1.0× TAE 电泳缓冲液 | |||
| CHEF Mapper XA 脉冲场电泳系统（含冷却模块和可变速泵） | Bio-Rad | ||
| λ DNA-HindIII 消化产物 | New England Biolabs | N3012S | |
| MidRange I PFG 标记物 | New England Biolabs | N3551S | |
| 10,000× SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | |
| 可微波塑料保鲜膜 | Saran premium wrap | ||
| Safe Imager 透射成像仪 | Invitrogen | S37102 | |
| GELase 琼脂糖凝胶消化试剂 | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| 手术刀片 | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Amicon Ultra-4 离心过滤单元（含 Ultracel-10 膜） | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Microcon YM-30 离心过滤单元 | EMD Millipore | 42410 | |
| 无核酸酶水 | Ambion | AM9932 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA 定量检测试剂盒 *2000 次检测*# | Invitrogen | P7589 | |
| 数字干式恒温仪 | VWR international | 12621-088 | |
| 水浴锅 | VWR international | 14231-854 | |
| 离心机 | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| 离心机转子 | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5415D | |
| 1.7 mL 透明微量离心管 | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| 15 mL 离心管 | Fisher Scientific | 430052 | |
| 第三步 | |||
| LB 液体培养基 | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| 噬菌体稀释缓冲液 | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3]，100 mM NaCl，10 mM MgCl2 | ||
| 冻存管 | Fisher Scientific | 430488 | |
| 第四步 | |||
| 带盖 96 孔板 | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| 带盖 384 孔板 | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| 培养皿 100 mm 直径 × 15 mm 高 | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 培养皿 150 mm 直径 × 15 mm 高 | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 × 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| LB 液体培养基 | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Difco 琼脂 | BD Biosciences | 214530 | |
| 玻璃珠 | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| 次氯酸钠溶液（漂白剂） | Javex | ||
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 15 mL 离心管 | Fisher Scientific | 430052 | |
| QPix 菌落挑选仪 | Genetix | QPix2 | |
| 挑菌头（大肠杆菌用） | Genetix | X4006 |
参考文献
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
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