一种多区室中枢神经系统神经元-胶质细胞共培养微流控平台

摘要

我们开发了一种新型的多区室神经元共培养微系统平台，用于体外研究中枢神经系统中轴突与胶质细胞的相互作用。该平台能够并行开展多达六项独立实验，并采用新开发的宏/微混合制造方法加工而成。

摘要

我们介绍一种新型的多区室神经元共培养微系统平台 体外 中枢神经系统轴突-胶质细胞相互作用研究，可同时进行多达六项独立实验，实现高通量。我们开发了一种新的制备方法，通过单次软光刻工艺即可在同一装置内构建出兼具微米和宏观结构的微流控器件，从而实现具有良好重复性的大规模制备。

多区室微流控共培养平台包含一个用于神经元的胞体区室和六个用于少突胶质细胞（OLs）的轴突/胶质区室。胞体区室与轴突/胶质区室通过阵列式轴突导向微通道相连，这些微通道作为物理屏障，可将神经元胞体限制在胞体区室内，同时允许轴突生长进入轴突/胶质区室。将少突胶质细胞接种至轴突/胶质区室后，其仅能与轴突发生相互作用，而无法接触神经元胞体或树突，从而实现局部化的轴突-胶质相互作用研究。这些微通道还可实现各区室间的流体隔离，使单个装置上可同时进行六项独立实验，提高通量。

使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的软光刻技术是生物医学微装置中常用的一种方法。这些装置上的储液池通常通过手工打孔来定义。尽管该方法简单，但由于对位不准且耗时，当需要重复大量制作储液池时，此方法并不适用。新开发的方法无需手工打孔，克服了上述局限性。首先，使用微铣削机在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）块上加工出七个储液池（深度：3.5 mm）。然后，将玻璃基底上制备的脊状微结构阵列通过热压法压印到PMMA块上，以形成连接胞体与轴突/胶质细胞区室的微通道。该过程使得宏观尺度的储液池（3.5 mm）和微观尺度的通道（2.5 μm）集成于同一块PMMA母模中。通过软光刻技术复制得到作为模具母模的PDMS复制品，并以此母模复制出最终的PDMS装置。

从E16-18大鼠分离的原代神经元被接种至胞体区，并培养两周。细胞培养一周后，轴突穿过微通道，在轴突/胶质区形成仅含轴突的网络层。轴突均匀生长至全部六个轴突/胶质区，并于培养第14天将P1-2大鼠的少突胶质前体细胞接种至轴突/胶质区 体外 用于共培养。

方案

第1部分：多区室神经元共培养装置制备的主模具准备

1. 制作PMMA母模的第一步是加工出3.5 mm深的腔室。使用微铣床（MDX-40，Roland，或任何其他CNC铣床）在PMMA块上定义一个胞体腔室和六个轴突/胶质细胞腔室。然后将PMMA母模在异丙醇中进行超声清洗10分钟，以去除碎屑。
2. 通过标准光刻工艺在50.8 mm × 50.8 mm的玻璃载片上制备高2.5 μm的脊状结构阵列，随后进行玻璃湿法刻蚀。
   首先，在经清洁的玻璃基底上使用正性光刻胶S1818通过光刻工艺定义脊状结构阵列。将S1818以4000 rpm转速旋涂于基底上，在110°C下前烘5分钟，随后使用掩膜对准仪进行紫外光曝光（84 mJ/cm²），再用MF319显影40秒。接着，将完成光刻胶图形化的玻璃基底在室温下浸入缓冲氧化物刻蚀液（BOE）中6–7分钟，以获得高2.5 μm的脊状结构。最后，使用丙酮和异丙醇去除光刻胶层，并用去离子水（DI水）彻底冲洗。
3. 将带有微脊结构的玻璃基底与PMMA母模进行热压印，以实现图案转移。
   首先，将PMMA模具母模与玻璃基底手动对准后置于热压机上。然后将温度升至115 °C。达到设定温度后，施加0.5吨压力并保持5分钟。5分钟后，降温至40 °C并释放压力。随后将PMMA母模切割成50.8 mm × 50.8 mm大小的块状。
4. 将PDMS预聚物（Sylgard 184）与固化剂按10:1的质量比混合。
5. 将PMMA母模放入模具盒中，并将PDMS混合液浇注于其上以制备PDMS母模。然后将其置于连接真空泵的干燥器中。浇注在PMMA母模上的PDMS需抽真空15分钟，以去除PDMS混合过程中产生的气泡。
6. 待所有气泡完全去除后，将PDMS放入水平放置的85 °C烘箱中加热1小时，使其完成聚合。
7. PDMS完全固化后，将其从PMMA母模上剥离，并放入干燥器中，加入2–3滴三氯硅烷后抽真空15分钟，使PDMS母模表面形成蒸汽涂层。三氯硅烷涂层有助于后续从PDMS母模上顺利脱模最终的PDMS神经元共培养器件。涂层完成后，用异丙醇短暂冲洗PDMS母模以去除过量的三氯硅烷，并用N₂气体吹干。

第2部分：神经元培养装置的复制

1. 将PDMS预聚物（Sylgard 184）与固化剂按10:1的重量比混合。
2. 将PDMS混合物倒入PDMS模具表面，并置于连接真空泵的干燥器中脱气15分钟。注意不要倒入过多PDMS，以免完全浸没模具上3.5 mm高的PDMS结构。
3. 待所有气泡完全去除后，将PDMS放入调平的85 °C烘箱中，加热一小时以完成聚合。
4. 一小时后将PDMS从烘箱中取出，在室温下冷却。随后，将PDMS神经元培养装置从PDMS模具上小心剥离。剥离后的PDMS装置用Parafilm包裹，以防灰尘或碎屑污染。
5. 用钻床配备刀片将包裹有Parafilm的PDMS装置切割成独立的单元。

第3部分：设备组装

1. 将PDMS神经元培养装置放入等离子清洗仪中，暴露于空气等离子体中90秒，以使PDMS装置表面具有亲水性。此等离子体处理有助于在组装后使微通道易于被培养基填充，当装置与聚-D-赖氨酸包被的基底结合时尤其重要。
2. 经等离子体处理后的装置随后浸入70%乙醇中30分钟以进行灭菌，并转移至无菌生物安全柜内。
3. 将灭菌后的装置从70%乙醇中取出，用经Millipore过滤的N₂气体吹干。干燥后的装置置于聚-D-赖氨酸包被的聚苯乙烯6孔培养板上，并施加轻柔压力，以确保基底与装置之间形成密封。
4. 随后向胞体区室中加入培养基，再依次填充六个轴突/胶质细胞区室。建议在向胞体区室加入培养基后，等待1–2分钟再填充轴突/胶质细胞区室，以确保微通道内无气泡残留。
5. 加入培养基的装置在37 °C培养箱中孵育过夜，以冲洗可能存在的碎屑或有毒残留物。

第4部分：细胞接种及神经元-少突胶质细胞共培养

1. 在细胞培养的第一天，将来自胚胎第16-18天大鼠的原代前脑神经元细胞以500个细胞/mm²的密度接种至胞体区室²首先，使用移液器吸除胞体区室和轴突/胶质细胞区室内的培养基，然后在细胞接种前将38500个细胞重悬于稀释液中 40 μl 培养基被加载到微通道入口周围的胞体室中。在加样细胞时，切勿触碰PDMS装置，因为这可能会破坏装置与基底之间的密封。
2. 将已接种细胞的装置置于 37 °C 孵育以促进细胞与基质的黏附。孵育后，所有腔室均加入培养基。
3. 细胞在以下条件下培养： 37 °C 在加湿的5% CO₂环境中₂ 培养箱中培养，每3-4天仅更换一半培养基。
4. 神经元培养14天后 体外，将少突胶质细胞加入轴突/胶质细胞区室进行共培养。少突胶质细胞取自出生后第1-2天的Sprague-Dawley大鼠大脑半球，以1000个细胞/mm²的面积密度加入每个轴突/胶质细胞区室²在接种细胞之前，用移液器吸出各隔室中约60%的培养基。操作时需注意不要触碰底部基质，以免损伤在基质上已形成的轴突网络。随后，将6700个少突胶质细胞悬浮于稀释液中 5 μl 将培养基加入轴突/胶质细胞区室中。细胞孵育1小时后，各区室补充培养基至满。
5. 细胞在培养条件下于 37 °C 在加湿的5% CO₂环境中₂ 培养箱中继续培养，每3-4天更换一半培养基，持续两周。

第5部分：代表性结果：

当实验操作正确时，加载至胞体区室的神经元细胞会靠近微通道入口，培养1周后，轴突/胶质区室内部开始形成轴突层。若在胞体区室内出现神经元细胞聚集现象，可能表明细胞状态不健康。在神经元培养两周后加载少突胶质细胞时，轴突/胶质区室应已被致密的轴突层覆盖，少突胶质细胞应接种于轴突层之上。

图1. 高通量微流控多区室中枢神经系统神经元共培养平台的示意图。横截面图显示了轴突与神经元胞体及树突的分离，以及通过微小液体液面差实现区室间的流体隔离。请点击此处查看图1的放大版本。

图2. 多腔室PDMS微流控共培养装置的制备与组装步骤。每个装置可适配于标准6孔聚苯乙烯细胞培养板中的一个孔。请点击此处查看图2的放大版本。

讨论

我们开发了一种用于研究哺乳动物中枢神经系统轴突-胶质细胞相互作用的多区室共培养平台。该装置成功实现了中枢神经系统轴突与神经元胞体/树突的分离，并实现了少突胶质细胞在装置内的共培养。神经元密度可根据具体应用进行调整，但密度过低或过高均可能导致细胞死亡。此外，更换培养基时仅需更换一半体积，以避免对基质上的细胞或轴突层造成损伤。我们预期该系统将成为研究中枢神经系统轴突-胶质细胞信号网络的有力工具。 体外 并为筛选促进髓鞘形成和髓鞘修复的生长因子或潜在药物候选物提供一条通向高通量平台的路径。