我们介绍一种从酵母Saccharomyces cerevisiae中快速高效纯化线粒体的方法。该方法能够高产量地分离出几乎不含其他细胞器污染的纯净线粒体，且纯化后的线粒体保持其结构和功能的完整性。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体是真核非光合作用细胞在有氧代谢过程中产生ATP的主要场所1这些复杂的细胞器在细胞凋亡过程中也发挥着至关重要的作用2, 细胞存活率3, 哺乳动物发育4，神经元发育与功能4, 细胞内信号传导5，以及寿命调控6. 我们对这些由线粒体调控的复杂生物过程的理解，依赖于评估其形态、蛋白质和脂质组成、DNA 完整性以及其众多重要功能的可靠方法。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，一种基因组已注释、蛋白质组明确且可进行遗传和生化操作的单细胞真核生物，是研究线粒体基本生物学功能所涉及的分子与细胞机制的宝贵模型。对于此类研究而言，获得高纯度的线粒体至关重要。本文详细介绍了一种快速且高效的酵母线粒体纯化方法。该方法能够分离出高度纯净的线粒体，基本无其他细胞器污染，并在纯化后保持其结构和功能的完整性。通过该方法纯化的线粒体适用于无细胞体系中重建关键线粒体过程，可用于线粒体结构与功能、线粒体蛋白质组和脂质组以及线粒体DNA的分析。
方案
材料与方法
酵母菌株及培养条件
野生型菌株 BY4742（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）在富含培养基 YEPD（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖）中培养。细胞在 30°C 条件下，以 200 rpm 的转速在锥形瓶中振荡培养，锥形瓶体积与培养基体积之比为 5:1。
粗线粒体组分的分离
- 培养野生型菌株BY4742 1 L，培养48小时。
- 将培养物倒入500 ml Nalgene离心管中。平衡后，在室温下以3000 × g离心5分钟收集细胞。
- 弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于250 ml去离子水中。室温下以3000 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
- 弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于250 ml去离子水中。在室温下以3000 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
- 测定细胞沉淀的湿重。
- 将沉淀的细胞重悬于DTT缓冲液中 [每克（湿重）细胞加入2 ml缓冲液]。
- 将细胞悬液转移至50 ml Falcon塑料管中。
- 在30°C下，以70 rpm的速度在摇床中旋转试管20分钟。
- 室温下以3000 × g离心5分钟收集细胞。
- 在Zymolyase缓冲液中重悬沉淀的细胞 无 Zymolyase [每克（湿重）细胞加7 ml缓冲液]。
- 离心收集细胞，室温下3000 × g离心5分钟。
- 在Zymolyase缓冲液中重悬沉淀的细胞 无 Zymolyase [每克（湿重）细胞加7 ml缓冲液]。
- 将细胞悬液转移至玻璃烧瓶中。
- 将Zymolyase-100T粉末加入细胞悬液中［每克（湿重）细胞加入1 mg Zymolyase-100T］。
- 在30°C下，以70 rpm的转速在摇床中旋转含有细胞悬液的烧瓶30分钟。
- 将经Zymolyase-100T消化细胞壁后形成的原生质球转移至50 ml塑料离心管中。
- 4°C 条件下，2200 × g 离心 8 分钟，沉淀球状体。
**所有后续步骤均应在 4°C 或冰上进行。应使用剪去尖端的移液管轻柔操作原生质球悬浮液，以避免破坏细胞器。**
- 将沉淀的球状体重悬于冰上预冷的匀浆缓冲液中 [每克（湿重）细胞加入6.5 ml缓冲液]。
- 在4°C下以2200 × g离心8分钟，收集球状体沉淀。
- 将沉淀的球状体重悬于冰上预冷的匀浆缓冲液中 [每克（湿重）细胞加入6.5 ml缓冲液]。
- 将细胞转移至预先在冰上冷却的玻璃匀浆器中。
- 使用紧密适配的研杵，上下研磨15次以充分匀浆细胞。
- 加入等体积的冰上预冷的匀浆缓冲液。
- 将匀浆后的球状体转移至50 ml塑料离心管中。
- 在4°C下以1500 × g离心5分钟，去除未破裂的细胞、细胞核及大块碎片。
- 将所得上清液在4°C下以3000 × g离心5分钟。
- 将所得上清液在4°C下以12000 × g离心15分钟。
- 倾去上清液，将沉淀重悬于冰上预冷的匀浆缓冲液中 [每克（湿重）细胞加入6.5 ml缓冲液]。
- 在4°C下以3000 × g离心5分钟。
- 将所得上清液在4°C下以12000 × g离心15分钟。
- 倾去上清液，将沉淀重悬于3 ml冰上预冷的SEM缓冲液中。
**尽管该悬液富含线粒体，但也含有其他细胞器，如内质网（微粒体）、高尔基体和液泡。为了获得纯净的线粒体，可对该粗线粒体组分进行进一步分级分离，如下所述。**
分离不含其他细胞器污染的线粒体
- 将1.5 ml预冷至冰上的60% (w/v) 蔗糖溶液（溶于EM缓冲液）加入Beckman Ultra-Clear离心管中。
- 在60% (w/v) 蔗糖溶液上依次铺加4 ml 32%、1.5 ml 23%、1.5 ml 15%的蔗糖溶液（均为w/v，溶于EM缓冲液）。
- 将3 ml粗线粒体组分（溶于SEM缓冲液）小心铺加在15% (w/v) 蔗糖溶液上方。
- 在4°C条件下，使用Beckman SW41 Ti水平转子离心1小时，离心力为134000 × g（33000 rpm）。
- 完整的线粒体将在60%/32%蔗糖界面处形成一条棕色条带。
- 小心移除上方蔗糖溶液，直至暴露线粒体条带。
- 使用剪去尖端的移液枪头吸取线粒体条带，并将其转移至适用于MLS-5转子的Beckman离心管中。
- 用SEM缓冲液充满离心管。
- 在4°C条件下，使用MLS-5转子以10000 × g（31000 rpm）离心30分钟，沉淀纯化的线粒体。
- 使用移液枪小心吸弃上清液。
- 将纯化的线粒体用于线粒体功能、线粒体蛋白质组与脂质组以及线粒体DNA的分析。
试剂
- DTT 缓冲液 [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9.4), 10 mM 二硫苏糖醇]（配制 15 ml）
- 1.5 ml 1 M Tris/H2SO4 缓冲液 (pH 9.4)
- 150 μl 1 M DTT
- 加水定容至 15 ml
- 蜗牛酶缓冲液 [20 mM 磷酸钾 (pH 7.4), 1.2 M 山梨醇]（配制 100 ml）
- 2 ml 1 M 磷酸钾缓冲液 (pH 7.4)
- 60 ml 2 M 山梨醇
- 加水定容至 100 ml
- 匀浆缓冲液 [10 mM Tris/HCl (pH 7.4), 0.6 M 山梨醇, 1 mM EDTA, 0.2% (w/v) BSA]（配制 250 ml）
- 2.5 ml 1 M Tris/HCl 缓冲液 (pH 7.4)
- 75 ml 2 M 山梨醇
- 500 μl 500 mM EDTA
- 0.5 g BSA
- 加水定容至 250 ml
- SEM 缓冲液 [10 mM MOPS/KOH (pH 7.2), 250 mM 蔗糖, 1 mM EDTA]（配制 250 ml）
- 2.5 ml 1 M MOPS/KOH 缓冲液 (pH 7.2)
- 31.25 ml 2 M 蔗糖
- 500 μl 500 mM EDTA
- 加水定容至 250 ml
- EM 缓冲液 [10 mM MOPS/KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA]（配制 250 ml）
- 2.5 ml 1 M MOPS/KOH 缓冲液 (pH 7.2)
- 500 μl 500 mM EDTA
- 加水定容至 250 ml
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讨论
该方法能够从酵母细胞中高效分离出高纯度的线粒体。通过该方法纯化的线粒体基本不含其他细胞器的污染，并在纯化后保持其结构和功能的完整性。所述方法获得的线粒体适用于无细胞体系中关键线粒体过程的重建。这些高纯度的线粒体还可用于线粒体结构与功能、线粒体蛋白质组和脂质组以及线粒体DNA的分析。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）的资助。V.I.T. 是 CIHR 新研究者奖获得者，以及康考迪亚大学基因组学、细胞生物学与衰老研究讲席。
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参考文献
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