LAD结扎：一种小鼠心肌梗死模型

Mandy V.V. Kolk; Danja Meyberg; Tobias Deuse; Karis R. Tang-Quan; Robert C. Robbins; Hermann Reichenspurner; Sonja Schrepfer

doi:10.3791/1438

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方法文章

LAD结扎：一种小鼠心肌梗死模型

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DOI：

10.3791/1438

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2009年10月14日

Mandy V.V. Kolk¹^,² , Danja Meyberg¹^,² , Tobias Deuse¹^,² , Karis R. Tang-Quan¹^,²^,³ , Robert C. Robbins³ , Hermann Reichenspurner¹^,² , Sonja Schrepfer¹^,²^,³

¹Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab (TSI), University Heart Center Hamburg, ²CVRC, University Hospital Hamburg, ³Department of CT Surgery, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

本视频演示了如何使用一种快速且可靠的模型来研究心肌缺血的病理生物学和病理生理学过程。

摘要

研究梗死和心肌缺血的模型对于探讨心肌缺血过程中急性和慢性阶段的病理生物学与病理生理学过程，以及开发和优化未来治疗方案至关重要。

在实验啮齿类动物中，有两种不同的方法可诱导心肌缺血。第一种方法是制造冷冻性梗死，这是一种快速但不精确的技术，通过将冷冻探针作用于心脏表面来实现（1-3）。使用该方法时，研究者无法确保冷冻瘢痕必然导致缺血，同时还会造成大范围的心肌损伤，引发与心肌梗死无关的病理生理学副作用。第二种方法是永久性结扎左前降支冠状动脉（LAD）。该方法通过单针缝合结扎LAD，几乎可立即形成缺血区域。通过闭合LAD，该区域的血液流动被完全阻断，而周围心肌组织则基本不受影响。这一手术操作能够模拟与梗死相关的心肌缺血所发生的病理生物学和病理生理学变化。

本视频介绍的方法展示了通过结扎左前降支（LAD）建立小鼠心肌梗死模型的手术操作。该模型适用于心肌梗死的病理生物学、病理生理学以及免疫生物学研究。该技术具有高度准确性，并与组织学切片结果具有良好相关性。

方案

从查尔斯河公司（Charles River，地址：Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld）购买8至12周龄、体重不低于20 g的Balb/C小鼠。
小鼠在常规条件下饲养，饲喂标准小鼠颗粒饲料并自由饮水 随意摄取使用异氟烷（2%）通过诱导室对小鼠进行麻醉。

剃除颈部区域和左侧肋骨区域的毛发，并使用80%乙醇进行消毒。
将小鼠仰卧放置，并在其鼻口部覆盖面罩以维持麻醉状态。
通过夹捏尾巴和后肢足部检查反射，以确保小鼠已达到足够的麻醉深度。
在显微镜下进行正中颈部切口，分离覆盖气管的皮肤、肌肉和组织。
暴露气管后，在声门下方两个软骨环之间的组织上剪开一个小孔，以插入气管插管（图1）。使用显微外科镊夹住气管的颅侧部分，插入气管插管。观察胸壁运动，确认双肺通气良好。
呼吸频率（RR）应约为每分钟110次，吸气压为17至18 cm H₂O。₂O. 小心地将小鼠翻转，使其仰卧于右侧，暴露其左侧。在第3肋间进行左侧开胸术^rd 以及 4^th 肋骨处小心分离组织和肌肉，使用电灼器防止出血。
小心打开胸腔，胸腔打开后，找到心脏，注意不要用任何锐器触碰肺部。随后去除覆盖在心脏表面的心包膜部分。
左前降支位于肺动脉和左心耳之间。使用8-0 Prolene缝线（Ethicon，Norderstedt，德国）在近端结扎左前降支，单一线结即可（图2）。
在第4肋间插入胸腔引流管（28G，静脉导管）^th 和 5^th 肋
逐层关闭胸腔切口，使用6-0 Prolene连续缝合线（Ethicon, Norderstedt, Germany）缝合肋骨，使用4-0 Prolene连续缝合线（Ethicon, Norderstedt, Germany）缝合皮肤。
使用2 ml注射器小心引流胸腔（图3）。将小鼠仰卧放置。随后取出气管插管，并用7-0 Prolene缝线（Ethicon，Norderstedt，德国）通过单针缝合将气管卡扣环固定。
将面罩放置于小鼠面部，并使用4-0 Prolene连续缝合线（Ethicon，Norderstedt，德国）缝合皮肤。

验证

有多种方法可以确认左前降支结扎手术的成功。

可在手术后6至18小时进行肌钙蛋白检测，仅需150 µL血液，无需处死动物。将血液加入定制的肌钙蛋白检测试剂盒（TROP T Sensitive，Roche，Mannheim）中（图4）。肌钙蛋白是肌细胞肌动蛋白丝中的一种调节蛋白，在三种肌肉类型中存在不同的同型异构体。其中cTnI和cTnT同型异构体存在于心脏中，并在组织损伤时释放。标准化的肌钙蛋白T（cTnT）检测基于两种心脏特异性的单克隆抗体，一种用于捕获血液样本中的肌钙蛋白，另一种作为标记物。

梗死区域在3天后可通过肉眼识别（图5）。

TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）染色用于检测组织活性，以评估梗死面积。将伊文思蓝染料（1,5%，1.0 mL）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，注入左心室腔，以测定心肌缺血区域。处死小鼠后取出心脏并切成片状。将组织切片置于1% TTC PBS溶液（pH 7.4）中，37°C孵育20分钟。随后将组织在10% PBS缓冲福尔马林中固定，2–8°C过夜。TTC在离体条件下染色伊文思蓝阴性区域（图6）。

进行组织学分析时，需处死小鼠并将其心脏包埋以进行后续处理。经过石蜡切片后，切片用苏木精和伊红（H&E）或三色染色法染色，以观察纤维化组织（图7）。

手术操作系列，骨暴露，机械操作，切口实验。
图1：气管插管。
1A：颈部腹侧切口后暴露的气管。
1B：在喉部尾侧两个软骨环处切开气管。
1C：将气管插管插入气管内。