从斑马鱼胚胎中提取RNA及用于基因表达分析的cDNA合成

摘要

高质量完整RNA的分离是许多实验室实验方案中的关键步骤。在此，我们展示了从完整的斑马鱼胚胎中提取RNA并合成cDNA，以用于后续多种实验操作，包括基因表达微阵列分析。

摘要

许多重要且复杂的实验操作需要高质量、完整的RNA作为起始材料。RNA样品的降解或杂质的存在可能导致下游实验应用出现严重问题。因此，采用具有多重保障措施和质量控制步骤的可靠技术，以获得优质样品，显得至关重要。本文详细介绍了一种利用市售化学变性剂从整只斑马鱼胚胎中提取总RNA的方案，并结合商业化RNA提取试剂盒进行后续纯化，以去除残留的DNA和杂质。由于RNA相对不稳定，且极易被RNase降解，大多数实验通常通过将RNA逆转录为更稳定的cDNA来检测基因表达，cDNA是以RNA为模板直接合成的。本文同时详述了利用市售试剂盒将RNA转化为cDNA的操作流程。在整个实验过程中设置了多项质量控制环节，以确保样品未发生降解或污染。本套方案最终获得的cDNA适用于微阵列分析、RT-PCR或长期保存。 关键词：RNA提取，斑马鱼胚胎，总RNA，cDNA合成，RNA纯化，质量控制，RT-PCR，微阵列分析

方案

第1部分：使用TRIzol试剂提取总RNA

处理RNA时，必须在无RNase的环境中操作。采取一些简单的预防措施非常有帮助，例如专用于RNA实验的移液器，以及在开始实验前用去污染试剂（如RNAse Away）喷洒工作区域。

1. 将50个斑马鱼胚胎放入1.5 ml离心管中，以获得足够量的RNA，并用移液器尽可能吸除多余水分。
2. 立即向含有胚胎的离心管中加入250 μl TRIzol试剂¹。TRIzol试剂含有苯酚，仅可在通风橱中使用。
3. 使用研磨杵（约20次上下研磨）裂解并匀浆胚胎，直至组织充分破碎。
4. 当细胞充分匀浆后，加入750 μl TRIzol试剂，使总体积达到1 ml。
5. 为使核蛋白复合物完全解离，将匀浆样品在室温下孵育5分钟。此时样品可用液氮速冻并保存于-80°C，或继续后续操作。
6. 继续操作时，加入0.2 ml氯仿，轻轻摇动离心管15秒以充分混匀。
7. 在室温下孵育2分钟后，于4°C以12,000 x g离心15分钟。
8. 混合物将分为下层红色酚-氯仿相、中间相和上层无色水相。RNA位于上层水相中。上层体积应约为初始TRIzol体积的60%（约0.6 ml）。使用1 ml移液器小心吸取上层水相转移至新的离心管中，注意避免吸取中间相。
9. 为沉淀RNA，加入0.5 ml异丙醇。
10. 室温静置10分钟后，于4°C以12,000 x g离心10分钟。RNA将在管底形成凝胶状沉淀。
11. 小心吸除上清液（勿扰动沉淀），用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。通过轻柔颠倒混匀样品，然后于4°C以7,500 x g离心5分钟。
12. 离心后，用移液器吸除乙醇，将样品倒置静置10分钟使其干燥。
13. 加入100 μl无RNase水重悬沉淀，并于55°C孵育10分钟。建议在孵育过程中频繁用手轻弹混匀，以促进RNA溶解。可选步骤：可使用NanoDrop ND-1000分光光度计检测样品的纯度与浓度，或直接进入下一步操作。

第2部分：使用Qiagen RNEasy Mini试剂盒进行RNA纯化

Qiagen RNEasy Mini Kit² 可有效去除通过其他方法分离得到的 RNA 样品中的污染物和杂质。本实验步骤除试剂盒所含组分外，还需使用 β-巯基乙醇、乙醇和无核酸酶水。建议在本实验过程中进行可选的 DNase 处理。

1. 首次使用试剂盒时，需通过向1体积的Buffer RPE中加入4体积的100%乙醇来配制Buffer RPE。
2. 在实验当天，需新鲜配制Buffer RLT。计算所需Buffer RLT的总体积，每份样品需要350 μl。每1 ml Buffer RLT中加入10 μl β-巯基乙醇进行配制。此操作应在通风橱中进行。
3. 向每份样品中加入350 μl Buffer RLT和250 μl 100%乙醇，通过反复吹吸数次充分混匀。
4. 将总体积约为700 μl的样品转移至置于2 ml收集管中的RNEasy柱中，在室温下以8,000 × g离心1分钟。
5. 离心后弃去穿流液，并向RNEasy离心柱中加入700 μl Buffer RW1。
6. 在室温下以8,000 × g离心1分钟，随后弃去穿流液。
7. 使用Qiagen无RNase DNA酶试剂盒进行DNA酶处理：DNA酶处理为可选步骤，但为获得最高质量的样品，强烈推荐执行此步骤。
   1. 首次收到DNA酶处理试剂盒时，需通过向DNA酶中加入550 μl无核酸酶水来配制DNA酶I储存液。轻轻颠倒混匀，切勿涡旋。将储存液分装至单次使用的小管中，每管含10 μl。储存液可在-20°C保存长达9个月。如需，解冻后的分装液可在4°C保存6周，但解冻后不可再次冷冻。
   2. 每份样品中，将70 μl Buffer RDD与10 μl DNA酶I储存液混合，配制DNA酶I孵育混合液。通过轻柔颠倒混匀，并短暂离心以收集管壁残留液体。将80 μl DNA酶I孵育混合液直接加入RNEasy离心柱中，在室温下孵育30分钟。
8. DNA酶处理完成后，向离心柱中加入350 μl Buffer RW1，并在室温下以8,000 × g离心1分钟。
9. 离心后弃去穿流液，并向离心柱中加入500 μl Buffer RPE。在室温下孵育样品5分钟。
10. 在室温下以8,000 × g离心1分钟，随后弃去穿流液。
11. 离心后向离心柱中加入500 μl 75%乙醇。
12. 重复离心步骤，在室温下以8,000 × g离心2分钟。
13. 离心后弃去穿流液，并将离心柱在室温下干燥5分钟。
14. 立即在室温下以8,000 × g离心5分钟，以去除残留的微量乙醇。
15. 离心完成后，将离心柱转移至新的1.5 ml收集管中，加入10 μl无核酸酶水。孵育1分钟后，在室温下以10,000 × g离心1分钟。RNA将存在于穿流液中。
16. 向离心柱中再加入10 μl无核酸酶水，在室温下孵育1分钟，然后在室温下以10,000 × g离心1分钟。
17. 离心后移除并弃去离心柱。RNA将存在于穿流液中。
18. 按照制造商说明书，使用NanoDrop ND-1000分光光度计检测RNA的浓度和质量。
19. 此外，可通过变性凝胶电泳或使用Agilent 2100生物分析仪检测RNA的完整性。
20. 样品应保存在-80°C，直至进行cDNA合成。

第3部分：使用Invitrogen SuperScript第一链合成系统进行cDNA合成

RNA 容易被 RNase 切割而发生降解。因此，许多基因表达实验方案都采用由 RNA 直接合成的更稳定的 cDNA 产物。本文详细介绍了使用 Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System³ 合成第一链 cDNA 的方法。每个 cDNA 合成反应最多可容纳 5 μg 的 RNA。

1. 开始实验前，将各组分混合并短暂离心。
2. 按照表1所述，在无菌的0.5 ml微量离心管中配制RNA/引物混合物。
3. 将样品在65°C孵育5分钟。
4. 立即转移样品至冰浴中，持续10分钟。
5. 在样品冷却期间，根据表2列出的组分配制预混液。所列体积为每1个反应的用量，请根据反应总数相应调整体积。
6. 冷却后，向每个RNA/引物混合物中加入9 μl步骤5中配制的预混液。轻轻混匀，并通过短暂离心收集液体。每个样品的总体积应为19 μl。
7. 将样品在热循环仪中于42°C孵育2分钟。
8. 向每管中加入1 μl（50单位）SuperScript II RT，混匀后在热循环仪中于42°C孵育60分钟。
9. 在70°C终止反应15分钟，然后将样品冷却至4°C。热循环仪可对步骤8和9进行程序化设置。
10. 待样品温度降至4°C后，将其转移至冰浴中。
11. 在冰上向每管中加入1 μl RNAse H，在37°C孵育20分钟。此时总体积为21 μl。加入RNAse H可降解样品中的RNA模板，仅保留单链cDNA产物。

第4部分：cDNA的分离与沉淀

1. 在cDNA产物的分离过程中将使用1.5 ml相锁凝胶管。通过在12,000 × g下离心2分钟来准备1.5 ml相锁凝胶管，确保凝胶完全沉降至管底。
2. 向相锁凝胶管中加入81.5 μl苯酚（Tris饱和，pH 8.0缓冲）、81.5 μl 24:1氯仿-异戊醇以及样品（21 μl）。轻轻颠倒数次以充分混匀。
3. 在室温下以12,000 × g离心样品5分钟。
4. cDNA应位于上层水相中。将上层水相转移至一支洁净的1.5 ml微量离心管中，总体积约为20 μl。
5. 加入1倍体积的3 M NaOAc（pH 5.2），并轻轻混匀。例如，若上层水相体积为20 μl，则需加入20 μl的3 M NaOAc（pH 5.2）。
6. 加入7 μl浓度为5 mg/ml的糖原，并轻轻混匀。
7. 加入1倍体积的异丙醇，并轻轻混匀。通常异丙醇的体积约为30 μl。
8. 将样品在室温下孵育10分钟，随后在室温下以12,000 × g离心20分钟。
9. 管底应形成少量cDNA沉淀。小心使用移液器吸除上清液。
10. 加入500 μl 70%乙醇，通过颠倒混匀。
11. 以12,000 × g离心样品5分钟。
12. 离心后用移液器吸除上清液，并重复70%乙醇洗涤及离心步骤（步骤10和11）。
13. 离心后用移液器吸除上清液。若管壁仍有残留液体，可通过短暂离心收集。彻底去除多余液体后，将沉淀在室温下干燥5分钟。
14. 加入20 μl无核酸酶水以重悬沉淀。将样品置于55°C下5分钟，以促进沉淀充分溶解。
15. 使用NanoDrop ND-1000分光光度计按照制造商说明书检测cDNA产物的浓度和质量。cDNA可于-20°C保存。

代表性结果

RNA纯化后，从50个斑马鱼胚胎中通常可获得约15 μg高质量的总RNA。为评估总RNA质量，可使用分光光度计、凝胶电泳以及Agilent 2100生物分析仪。可使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定260 nm处的吸光度与280 nm处吸光度的比值（图1）。A₂₆₀/A₂₈₀比值可反映是否存在污染物，并提示可能发生的降解。A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.9–2.0之间视为可接受。此外，强烈建议通过RNA变性凝胶电泳来评估RNA完整性。RNA链将根据其大小分离，较小的RNA链在凝胶中迁移得更远。未降解的样品在凝胶上呈现为弥散条带，并伴有两条明显的条带。弥散条带由不同长度的mRNA群体形成，而两条明显条带分别对应28S和18S rRNA。28S条带的强度应约为18S条带的两倍（图2）。或者，也可使用Agilent 2100生物分析仪评估总RNA完整性。预期可见两个代表28S和18S rRNA的明显峰形。28S峰应大于18S峰，且两峰下的面积之比约为2:1。在已降解的样品中将无法观察到两个明显的峰。出现降解迹象的RNA样品不应继续用于后续实验操作。

分光光度法分析可用于评估cDNA产物的质量（图4）。A₂₆₀/A₂₈₀比值应约为1.8。在本实验室，以5 μg总RNA为起始量进行cDNA反应，通常可获得1–2 μg的cDNA产物。

图1. RNA样品的NanoDrop光谱图。 RNA纯化后，可使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定RNA的浓度和质量。通常从50个斑马鱼胚胎中可获得约15 μg高质量的总RNA，其A₂₆₀/A₂₈₀比值约为1.9–2.0。

图2. RNA变性凝胶电泳图。 为评估总RNA提取的完整性，可进行RNA变性凝胶电泳。预期结果为一条带有两条明亮条带的弥散信号，分别对应于28S和18S rRNA。其中28S条带的强度应约为18S条带的两倍。

图3. 生物分析仪检测的RNA样品图谱。 为评估总RNA提取的完整性，可使用Agilent 2100生物分析仪对样品进行分析。应可见两个清晰的峰，分别对应28S和18S rRNA。28S峰应大于18S峰，其峰下面积之比约为2:1。

图4. cDNA样品的NanoDrop光谱。 使用NanoDrop ND-1000进行分光光度分析，可用于评估cDNA产物的浓度和质量。A₂₆₀/A₂₈₀比值应约为1.8。在本实验室，以5 µg总RNA为起始量的cDNA反应通常可获得1–2 µg的cDNA。

表1. cDNA合成步骤2中需加入的RNA/引物混合物组分。

组分	体积
总RNA（最多5 μg）	10 μl
10 mM dNTP混合物	1 μl
Oligo(dT)12-18（0.5 μg/μl）	1 μl
DEPC处理水	n μl
总体积	10 μl

表2. cDNA合成第5步的反应体系。所列体积为单次反应所需量。根据反应总数按比例增加各组分的体积。

组分	体积
10X RT Buffer	2 μl
25 mM MgCl2	4 μl
0.1 mM DTT	2 μl
RNAseOUT	1 μl

讨论

在整个实验方案中，最需要牢记的是RNA分子的不稳定性。应始终在无RNA酶的实验室区域使用无菌且无RNA酶的实验器材。建议将实验室的某一区域专门用于RNA相关操作，并定期使用去除RNA酶的产品（如RNAse Away）进行喷洒处理。操作RNA样品时必须佩戴手套，并将其置于冰上保存，以防止降解。

本实验方案采用了市售的试剂和试剂盒。此外，市场上还有多种其他试剂和用于总RNA提取的RNA提取试剂盒可供选择。本方案中包含的试剂和试剂盒在本实验室中表现良好， routinely 获得高质量的RNA。

作为替代方案，可进行双链 cDNA 的合成，而非本方案中演示的单链 cDNA 合成。有时需要双链 cDNA，因其具有更高的稳定性。此外，某些实验方案要求以双链 cDNA 产物作为起始材料。然而，如果样品将在本实验室用于后续实验，则单链 cDNA 合成已足够，且成本更低。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
糖原（5 mg/ml）	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
微型离心管用研磨杵	VWR international	KT749520-0090
相锁凝胶轻型，1.5 ml	Eppendorf	2302800
Tris饱和酚	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
无RNA酶DNase试剂盒	Qiagen	79254
RNEasy Mini试剂盒	Qiagen	74104
SuperScript® RT-PCR用第一链cDNA合成系统	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026