从斑马鱼胚胎中提取RNA及用于基因表达分析的cDNA合成

摘要

高质量完整RNA的分离是许多实验室实验方案中的关键步骤。在此，我们展示了从完整的斑马鱼胚胎中提取RNA并合成cDNA，以用于后续多种实验操作，包括基因表达微阵列分析。

摘要

许多重要且复杂的实验操作需要高质量、完整的RNA作为起始材料。RNA样品的降解或杂质的存在可能导致下游实验应用出现严重问题。因此，采用具有多重保障措施和质量控制步骤的可靠技术，以获得优质样品，显得至关重要。本文详细介绍了一种利用市售化学变性剂从整只斑马鱼胚胎中提取总RNA的方案，并结合商业化RNA提取试剂盒进行后续纯化，以去除残留的DNA和杂质。由于RNA相对不稳定，且极易被RNase降解，大多数实验通常通过将RNA逆转录为更稳定的cDNA来检测基因表达，cDNA是以RNA为模板直接合成的。本文同时详述了利用市售试剂盒将RNA转化为cDNA的操作流程。在整个实验过程中设置了多项质量控制环节，以确保样品未发生降解或污染。本套方案最终获得的cDNA适用于微阵列分析、RT-PCR或长期保存。 关键词：RNA提取，斑马鱼胚胎，总RNA，cDNA合成，RNA纯化，质量控制，RT-PCR，微阵列分析

方案

第1部分：使用TRIzol试剂提取总RNA

处理RNA时，必须在无RNase的环境中操作。采取一些简单的预防措施非常有帮助，例如专用于RNA实验的移液器，以及在开始实验前用去污染试剂（如RNAse Away）喷洒工作区域。

1. 将50个斑马鱼胚胎放入1.5 ml离心管中，以获得足够量的RNA，并用移液器尽可能吸除多余水分。
2. 立即向含有胚胎的离心管中加入250 μl TRIzol试剂¹。TRIzol试剂含有苯酚，仅可在通风橱中使用。
3. 使用研磨杵（约20次上下研磨）裂解并匀浆胚胎，直至组织充分破碎。
4. 当细胞充分匀浆后，加入750 μl TRIzol试剂，使总体积达到1 ml。
5. 为使核蛋白复合物完全解离，将匀浆样品在室温下孵育5分钟。此时样品可用液氮速冻并保存于-80°C，或继续后续操作。
6. 继续操作时，加入0.2 ml氯仿，轻轻摇动离心管15秒以充分混匀。
7. 在室温下孵育2分钟后，于4°C以12,000 x g离心15分钟。
8. 混合物将分为下层红色酚-氯仿相、中间相和上层无色水相。RNA位于上层水相中。上层体积应约为初始TRIzol体积的60%（约0.6 ml）。使用1 ml移液器小心吸取上层水相转移至新的离心管中，注意避免吸取中间相。
9. 为沉淀RNA，加入0.5 ml异丙醇。
10. 室温静置1....

讨论

在整个实验方案中，最需要牢记的是RNA分子的不稳定性。应始终在无RNA酶的实验室区域使用无菌且无RNA酶的实验器材。建议将实验室的某一区域专门用于RNA相关操作，并定期使用去除RNA酶的产品（如RNAse Away）进行喷洒处理。操作RNA样品时必须佩戴手套，并将其置于冰上保存，以防止降解。

本实验方案采用了市售的试剂和试剂盒。此外，市场上还有多种其他试剂和用于总RNA提取的RNA提取试剂盒可供选择。本方案中包含的试剂和试剂盒在本实验室中表现良好， routinely 获得高质量的RNA。

作为替代方案，可进行双链 cDNA 的合成，而非本方案中演示的单链 cDNA 合成。有时需要双链 cDNA，因其具有更高的稳定性。此外，某些实验方案要求以双链 cDNA 产物作为起始材料。然而，如果样品将在本实验室用于后续实验，则单链 cDNA 合成已足够，且成本更低。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
糖原（5 mg/ml）	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
微型离心管用研磨杵	VWR international	KT749520-0090
相锁凝胶轻型，1.5 ml	Eppendorf	2302800
Tris饱和酚	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
无RNA酶DNase试剂盒	Qiagen	79254
RNEasy Mini试剂盒	Qiagen	74104
SuperScript® RT-PCR用第一链cDNA合成系统	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026