可扩展的流体注射器阵列用于病毒靶向完整三维脑环路

摘要

通过一种可将病毒及其他试剂递送至目标三维脑区的技术，将有助于实现对神经环路的 in vivo 控制与分析。我们展示了定制化流体注射器阵列的制备，以及病毒编码的光敏蛋白的递送，从而实现对复杂脑环路的光操控。

摘要

我们对神经环路的理解——即它们如何介导支持感觉、思维、情绪和行为的计算过程，以及它们在神经和精神疾病中如何被破坏——将因一种能够快速将基因靶向复杂三维神经环路的技术而得到极大促进，从而实现“环路水平转基因”的快速构建。我们近期开发了若干方法，利用编码光敏感蛋白的病毒，可在完整大脑中使特定细胞类型对毫秒时间尺度的激活和抑制产生响应。本文介绍了可将病毒（或其他液体）递送至大脑三维结构内数十个预定位置的注射器阵列的设计与实现方案图 1A、1B). 注射器阵列包含一个或多个位移泵，每个位移泵驱动一组注射器，每支注射器通过耐高压连接器将液体输送至聚酰亚胺/熔融石英毛细管。毛细管根据尺寸定制，并插入立体定位支架板上通过定制铣削加工确定的指定位置，从而可将病毒或其他试剂递送至目标脑区。使用该装置时，外科医生首先将流体子系统完全填充油液，再将病毒溶液反向填充至毛细管中，随后将装置插入脑组织，并以缓慢速度（<0.1 微升/分钟）灌注试剂。由于注射器阵列具有并行操作特性，可实现对完整神经环路进行快速、准确且稳健的标记，所递送的病毒载荷包括光敏剂等，可用于激活或抑制特定脑回路。结合其他技术，例如用于向目标脑区递送光信号的光纤阵列，我们希望构建一套工具箱，以实现对完整大脑中神经功能的系统性因果探究。该技术不仅有望为哺乳动物中以环路为中心的神经科学研究提供系统性研究手段，并促进在非人灵长类等大型动物脑区的标记，还可能为细胞特异性的光学控制假体开辟临床转化路径，其高精度特性有望改善难治性脑部疾病的治疗。最后，本文所述的此类装置还可实现对干细胞和药理学试剂等其他载荷向三维结构进行精确时序的流体递送，并且具备高度用户可定制性。

方案

1. 构建立体定位夹具

1. 立体定位夹用于将注射器阵列固定在立体定位仪上，使注射器与立体定位臂保持平行。
2. 每个实验室只需一个夹具，除非预计会同时进行多台手术。在此情况下，应制作与预计最大同时手术数量相同的夹具数量。此外，建议额外制作一个备用夹具，以防主夹具损坏。
3. 制作立体定位夹时，首先将外径（OD）为1.5 mm的钢制套管切割成2英寸长，并用Dremel工具将其中一端打磨平整。
4. 接着，从PCB原型板上切割出一小块（约0.5 × 0.5 cm）作为间隔垫片。
5. 使用激光切割机确保所有切割边缘与材料表面垂直，从1/8英寸厚的亚克力板上切割出两个相同的矩形（1/2英寸 × 3/8英寸），每个矩形在对角的两个角上各有一个圆形孔。第一个孔直径为1.5 mm，刚好能紧密固定金属套管；第二个孔直径为1/16英寸（图1C）。
6. 将金属套管插入第一个矩形的1.5 mm孔中，再穿过第二个矩形的1.5 mm孔。套管底端与下方矩形的底面齐平，形成曲棍球棒形状。
7. 在将间隔垫片紧密夹在两个矩形之间的前提下，使用热熔胶沿套管及1.5 mm孔周围进行粘合固定，注意避免将垫片本身粘到矩形上。在此过程中，可使用油泥辅助固定各部件。
8. 待胶水完全干燥后，从矩形上方的1/16英寸孔中插入一个1-72螺钉，然后将一个1-72六角螺母拧到螺钉末端并拧紧。螺钉与螺母共同起到固定夹具结构的作用。
9. 为将六角螺母固定在下方矩形的底面，需在螺母边缘滴加少量5分钟快干环氧树脂，注意不要让环氧树脂进入螺母或螺钉的螺纹部分。清除所有油泥，并确认通过拧紧螺钉可牢固固定间隔垫片。

2. 为定制注射器阵列准备系统：Hamilton泵与立体定位仪

1. 注射器阵列系统可针对大脑中几乎任意坐标位置进行定制。
2. 用户首先在小鼠（或其他物种）脑图谱中定位所需注射位点的坐标，并转换为立体定位仪所使用的相应坐标（此处为 X、Y 和 Z 坐标）。注射位点的数量（此处为三个） 图1A和图1B) 此后称为 k.
3. k 数量 10 μl 哈密尔顿注射器置于注射/抽吸式注射泵中，例如哈佛仪器公司的此类设备。
4. 接下来，将长3英尺的聚乙烯管牢固地连接到每个汉密尔顿注射器的针头上。
5. 对于每一段聚乙烯管，将Upchurch Scientific公司的F-252管套滑过管子的开口端，并使用配套的螺母和卡环（均来自Upchurch Scientific）将其固定在P-627管接头上。

3. 构建定制化注射器阵列

1. 每个注射器阵列均根据用户选择的坐标集进行定制。然而，对于仅通过平移和/或旋转相互区别的坐标集，可使用相同的注射器阵列。
2. 仅考虑注射位点的相对 X 和 Y 坐标，在厚度为 1/32" 的 PCB 原型板上钻出 k 个孔，孔间距与坐标相对位置一致。使用 Modela 微型铣床和 McMaster-Carr 提供的直径为 0.011" 的钻头进行钻孔。务必采用较慢的钻孔速度（Z 轴速度），以避免钻头断裂或过度磨损。在将板从铣床上取下之前，使用直径为 1/32" 的较大钻头在小孔周围钻出一个矩形，以避免磨损较小的钻头。Mini mill 的代码可使用 MATLAB 轻松生成；以下文件中提供了示例代码。
   1. generate.m - 从目标坐标生成 Modela 代码的 MATLAB 代码
   2. holes_ex.rml - 在原型板上钻环形图案（八个孔）的 Modela 代码
   3. outline_ex.rml - 在孔周围钻矩形的 Modela 代码
3. 从 Polymicro Technologies 获取外径 245 μm、内径（ID）100 μm 的熔融石英毛细管，将其切割成 k 段，每段长 3 英寸，作为单个注射器。将一段一次性毛细管穿过每个孔，以清除碎屑，避免堵塞实际使用的注射器。随后将注射器插入每个孔中一半深度，使其被牢固固定且彼此平行。用环氧树脂将注射器粘接到板上，形成注射器阵列的结构。最后只需将注射器修剪至正确长度即可。
4. 通过将原型板的一个角置于丙烯酸矩形块之间，并拧紧立体定位夹具的螺丝，将注射器阵列固定到立体定位夹具上。然后使用立体定位仪的连接装置将夹具的金属套管连接到立体定位仪上。
5. 以下所有操作均在显微镜下进行。选择其中一个外侧注射器（即可以从侧面用直边接近而不碰到其他注射器的注射器），用剪刀剪去其从原型板底部伸出的尖端。对于皮层注射，注射器从原型板表面伸出约 5 mm 较为合适。对于更深的注射，可根据深度相应增加该长度。使用 Dremel 工具将尖端压平。若对深度精度要求不高，也可将注射器尖端磨成一定角度，以进一步防止堵塞。
6. 接下来，在立体定位臂可及范围内选择一个稳定的参考点，并移动注射器阵列，使外侧注射器的压平尖端位于该参考点处。
7. 选择第二个注射器及其对应的坐标，计算第一个与第二个注射器坐标之间在高度方向（Z 方向）的相对差异。将注射器阵列沿 Z 轴移动该相对距离。修剪并打磨第二个注射器至合适长度，使其尖端平整并处于参考点高度。可沿 X 和 Y 方向移动注射器阵列，以便于比较注射器尖端与参考点的位置。
8. 对剩余的注射器重复上述修剪过程。

4. 组装整个系统

1. 此步骤需要使用已制备好的立体定位夹具和定制的注射器阵列。
2. 将每个注射器的后端（未修剪的一端）插入蓝色F-240管套中，并使用Upchurch Scientific公司的P-235螺母和P-200卡环，将其连接至已通过聚乙烯管与Hamilton泵相连的螺纹适配器上。具体操作可参考制造商的说明书。
3. 使用27号针头将硅油注入Hamilton注射器的后部，使整个系统从Hamilton注射器到注射器尖端完全充满硅油，不得有任何气泡。
4. 当Hamilton注射器重新装入Hamilton泵时，应尽量在注射器内保留最大可能体积的硅油。
5. 如果实验所需的注射器数量超过泵的设计容量（本例中为两个），可使用小块塑料材料（例如针头帽）将注射器隔开，以保持彼此平行，并确保所有注射器被泵推动的程度一致。或者，可从Harvard Apparatus公司购买多支架升级套件，以同时容纳多达10个注射器。

5. 注射/手术

1. 使用平行注射器进行注射的过程与使用单根移液管进行注射非常相似。
2. 在整个过程中必须使用缓慢的回吸/灌注速率，因为快速泵送可能会对粗细管之间的连接处造成应力。推荐的最大速率为：加载病毒时为 2 μl/min，灌注病毒时为 0.1 μl/min。
3. 将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中，并在整个实验过程中保持麻醉状态。
4. 根据需要准备小鼠。例如，使用手术刀从两眼之间至两耳之间沿中线做一纵向切口，将皮肤向两侧拉开以暴露颅骨，并清除筋膜组织。将拉制好的玻璃移液管安装到立体定位仪上。调节耳杆的位置，使前囟（bregma）和后囟（lambda）处于同一高度，且连接它们的直线与立体定位仪的 Y 轴平行。根据注射坐标所采用的坐标系调整立体定位仪的各轴方向。将玻璃移液管尖端置于前囟处进行归零，然后将尖端移动至某一注射位点的 X 和 Y 坐标上方略高位置。
5. 使用牙科钻小心磨除移液管尖端下方的颅骨，直至仅剩一层极薄的骨片。可通过 lowering 和 raising 玻璃移液管来检查所钻孔位是否居中。使用 30 号针头，在正确的 X 和 Y 坐标处轻轻挑去一小块残留骨片，以暴露硬脑膜。该孔的大小应刚好能容纳一个注射器（宽 0.25 mm）。参见 图 1D 示意图。以相同方法在每个注射位点对应的 X 和 Y 坐标处制作多个宽 0.25 mm 的小孔。
6. 将玻璃移液管丢弃至锐器容器中，并使用立体定位仪的夹具将定制的注射器阵列固定在立体定位仪上。
7. 为正确设定注射器阵列的角度，需选择两个外侧注射器对准某一参考点，具体如下：在将其中一个注射器与参考点对齐后，考虑该注射器与其他某一注射器之间的相对 X 和 Y 距离。调节立体定位仪的各轴，使整个注射器阵列在 X 和 Y 方向上移动相应的相对距离。若第二个注射器此时未与参考点对齐，则松开金属套管并旋转调整。重复此过程，直至注射器阵列的角度正确。
8. 在向注射器中填充病毒之前，先用硅油填充注射器，直至注射器刻度达到 2 μl 位置（或更高）。此举可建立缓冲区，以便通过 Hamilton 泵向前推动油液即可轻松清除尖端的气泡或堵塞，而无需像此前所述那样从注射器后端重新整体填充硅油。
9. 在颅骨上放置一片无菌的 Parafilm 膜，然后将注射器阵列轻轻下放至 Parafilm 膜表面。对于深度差异较大的坐标，可使用定制铣削部件（例如阶梯状物体）辅助加载。
10. 以下步骤假设每个位点需加载 1 μl 病毒（若需更小体积，则应按比例缩小以下体积）。为确保每个位点注入的病毒量 >1 μl，需在每个注射器尖端的 Parafilm 膜或阶梯状物体上滴加 1.5 μl 病毒液。
11. 将 Hamilton 泵的回吸速率设为 1 μl/min，将 1.2 μl 病毒液回吸至每个注射器中。
12. 将最长注射器的尖端在前囟处归零，然后将注射器阵列移至该注射器的 X 和 Y 坐标位置。若存在堵塞问题（例如涉及多个深层靶点），建议在将注射器尖端插入脑组织之前，先启动泵以灌注模式运行，直至观察到所有注射器尖端均有病毒液渗出。这可清除注射器尖端的气泡，并确保无堵塞。若发生堵塞，可将 Hamilton 泵设为以 2 μl/min 的较高速度短暂脉冲灌注，以轻柔清除堵塞。
13. 随后将注射器阵列通过 30 号针头制作的小孔缓慢下放至正确的 Z 深度。
14. 通过每个注射器以 0.1 μl/min 的速率注入 1 μl 病毒液。
15. 注射完成后静置 30 分钟。
16. 缓慢将注射器阵列从脑组织中抽出后，将 Hamilton 泵设为以相同的 0.1 μl/min 速率继续灌注，以检测每个注射器是否存在堵塞。
17. 然后通过以 2 μl/min 的速率回吸并灌注 1.5 μl 乙醇来清洗注射器。
18. 最后，用硅油重新填充注射器，以维持每个 Hamilton 注射器中 2 μl 的缓冲区。
19. 所有设备应在操作前后根据您所在机构的生物安全和动物使用规程进行灭菌处理。

6. 代表性结果

平行注射器阵列可将手术速度提高约相当于注射器数量的倍数，此计算未包含准备和恢复时间，但具体操作时间仍取决于操作者的技术水平。对于1 µL的注射，我们通常观察到慢病毒表达呈球形分布，直径约为1 mm（图1E）。注射精度较高，多次实验间针尖定位的变异程度约为45 µm（针尖实际位置与目标位置之间距离的标准差）。

图1. 并行病毒注射器阵列的设计、实施与使用 A，平行注射器阵列系统的示意图，显示三重注射器构型，用于三次同步注射。 B, 如图所示的三通道平行注射器阵列照片 A. C, 立体定位夹，从顶部以轮廓形式显示。 D, 一种高效且最小化损伤的颅骨开孔技术示意图，用于将注射器插入脑组织：使用牙科钻将颅骨磨薄至约50微米厚度，然后用锋利针尖刺开一个小的颅窗。 E荧光图像显示由三通道注射器阵列靶向的小鼠大脑皮层三个区域中表达通道视紫红质-2（ChR2）-GFP的细胞 B.

讨论

近年来，多种基因编码的光敏蛋白实现了以精确的时间控制方式，通过短暂的光脉冲在活体（in vivo）中激活或抑制神经元（例如，^{1,4,5,6,7,8,11}）。在哺乳动物大脑中使神经元对光敏感的一种关键方法是利用病毒，如慢病毒和腺相关病毒（AAV），这些病毒能够以安全且持久的方式将编码视蛋白的基因递送至从鼠类到猴类等多种动物的大脑中（例如，^2,9,10）。与转基因技术相比，病毒方法具有更短的周期，尤其适用于大鼠和猴类等非经典遗传模式生物；此外，病毒可实现视蛋白的高表达水平，而这一点在转基因模型中可能难以达到。本文展示了一种并行注射器阵列，可在短时间内实现“回路水平的转基因”操作，仅通过一次手术步骤即可将目标基因病毒性地靶向整个三维脑结构。该注射器阵列包含一个或多个位移泵，每个泵驱动一组注射器，每支注射器通过耐高压连接器将液体输送至聚酰亚胺/熔融石英毛细管。毛细管经尺寸定制后，插入由定制铣削立体定位板所确定的特定位置，从而实现将病毒或其他试剂递送至预定的一组脑区。使用该装置时，操作者首先将流体子系统完全充满油，用病毒溶液反向填充毛细管，将装置插入脑组织，并以缓慢速度（<0.1 μL/min）灌注试剂。

该技术将能够实现多种全新的实验，例如在行为过程中精确的时间点，以毫秒级的时间尺度关闭复杂形状的脑结构（如海马体）；对可能具有冗余功能的双侧结构（如左右杏仁核）进行时间上精确的失活；以及对多个离散脑区进行扰动（例如，使两个相互连接的脑区活动不同步，以研究跨区域同步性如何依赖于各区域内活动，或在刺激某一脑区输入通路的同时沉默其部分靶细胞，以明确多个靶点中哪些对介导这些输入效应至关重要）。对于灵长类动物的大脑——我们近期已在其中实现了光控细胞类型特异性神经元激活³——在与行为相关的脑区进行活动扰动可能需要对大而复杂的结构进行病毒标记。我们注意到，平行注射器阵列可用于以精确的时间控制方式，将几乎任何类型的载荷——药物、神经调节物质、神经递质，甚至细胞——以复杂的三维模式注入大脑。最后，从转化医学的角度来看，有可能快速定制设计和制造基因治疗或药物递送装置，以匹配个体化的脑部几何结构，从而通过光学控制分子的手段，为多种疾病提供新的治疗方案。

注射器阵列在空间和体积上均具有高精度。在X轴和Y轴方向上，通过使用低成本的微型铣床精确钻出位置准确的孔来实现精度，孔径仅略大于注射器，以确保注射器彼此平行并精确定位。在Z轴方向上，使用立体定位装置修剪注射器，使其精度与立体定位手术本身的精度相当。体积精度来源于Hamilton泵的精确性，以及借鉴高效液相色谱（HPLC）领域而来的近零死体积连接件。注射器由熔融石英毛细管制成，其强度和刚性足以在压力下保持精确的形状和间距，且管壁厚度远小于钢制套管等替代材料。通过简单的修改，可轻松将平行注射器阵列适配于多种实验。例如，若需要更小的病毒注射体积或更小的间距，可采用更细的毛细管及相应尺寸的钻头。未来的装置可能采用微流控通道和泵，以增加平行注射器的数量，并减小装置尺寸（或许可实现将装置安装于自由活动动物头部）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dremel 工具	工具	Dremel	3956-02
激光切割机	工具	Universal Laser Systems	VLS2.30
热熔胶枪	工具	Stanley Bostitch	GR20
注射/回抽注射泵（Hamilton 泵）	工具	Harvard Apparatus	702001
10 μl Hamilton 注射器	工具	Hamilton Co	701N	每个注射位点需配备一个
小鼠立体定位仪	工具	Stoelting Co.	51725D
Modela 微型铣床	工具	Roland	MDX-15
微型铣床用直径 0.011" 钻头	工具	McMaster-Carr	8915A12
微型铣床用直径 1/32" 钻头	工具	McMaster-Carr	8848A35
高速牙科钻机	工具	Lynx	333
牙科钻机配件	工具	Pearson Assessments	F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38
外径（OD）1.5 mm 的不锈钢套管	材料	Small Parts, Inc.	HTX-15R
1-72 槽式紧固螺钉	材料	Small Parts, Inc.	MX-0172B
1-72 六角螺母	材料	Small Parts, Inc.	HNX-0172
PCB 原型板，厚度 1/32"	材料	Digi-Key	PC57-T-ND
亚克力板，厚度 1/8"	材料	McMaster-Carr	8560K239
HPLC 连接件	材料	Upchurch Scientific	F-252, P-627, P-200, P-235, F-240（其中部分可购买 10 件装；只需在货号末尾添加 ‘x’）	每个注射位点每次注射需配备一个，但 F-252、P-627 和 P-235 可重复使用
熔融石英毛细管，外径：245 μm，内径：100 μm	材料	Polymicro Technologies	2000022-10M
5 分钟通用环氧树脂	材料	Permatex	84101	5 分钟通用环氧树脂
聚乙烯管，0.066 英寸 × 0.095 英寸	材料	VWR international	63018-827