制备慢病毒时，将DNA载体转染至人293细胞中。收集并浓缩上清液后，通过流式细胞仪检测荧光表达来测定病毒滴度。
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本文内容
摘要
摘要
RNA干扰（RNAi）是活细胞中一种基因沉默系统。在RNAi过程中，与短干扰RNA（siRNA）序列同源的基因在转录后水平被沉默。短发夹RNA（shRNA）是siRNA的前体，可通过慢病毒进行表达，从而实现多种细胞类型的RNAi。慢病毒（如人类免疫缺陷病毒）能够感染分裂和非分裂细胞。本文将描述一种慢病毒包装的实验流程。包装是指从DNA载体中制备具有感染能力的病毒颗粒。慢病毒载体生产系统采用“分拆”策略，即将天然病毒基因组拆分为多个独立的辅助质粒。将不同的病毒元件分别构建在四个独立载体中，可显著降低因慢病毒基因组意外重组而产生具有复制能力病毒的风险。在此方法中，将含有目标shRNA的载体以及三个包装载体（p-VSVG、pRSV、pMDL）瞬时转染至人293细胞中。转染后至少培养48小时，收集含病毒的上清液并进行浓缩。最后，通过流式细胞仪检测报告基因（荧光）的表达水平，测定病毒滴度。
RNA干扰, 慢病毒包装, shRNA, siRNA, 基因沉默, 293细胞, 病毒滴度, 流式细胞术, 转染, 基因表达调控
方案
第1部分：转染HEK 293细胞以生产慢病毒
*转染前24小时，将2.5 × 106个细胞接种于10 cm培养皿中，使次日细胞融合度达到50–70%。
- 首先准备用于后续转染细胞以产生病毒的DNA。在1.5 ml离心管中，用移液器加入FuGENE 6 Transfection Reagent Roche——一种可促进细胞摄取DNA的脂质转染试剂，并进行稀释。 30μl 将 FuGENE 6 加入 600 μl 无血清培养基（SFDMEM）中。加入时注意避免 FuGENE 接触离心管管壁。将 FuGENE 与 SFDMEM 混合后，室温孵育 5 分钟。
- 在管盖中混合 4 μg 带有慢病毒质粒的 4 μg 每个 3rd 生成病毒包装载体（pMDL、pRSV 和 pVSV-G）。慢病毒质粒包含病毒在感染每个细胞时将其插入宿主基因组的DNA，而包装载体则包含生成慢病毒所需的所有其他蛋白质的基因。
- 盖上管盖，通过反复倒置试管混匀。
- 室温孵育15-20分钟。
- 将管中的全部内容用移液器转移至293细胞培养板中。通过轻轻前后倾斜培养板混匀。
- 将细胞放回培养箱，使病毒生产持续 48–96 小时后再进行收获。
- 孵育期间，293细胞从慢病毒质粒中转录目的DNA，产生慢病毒构建体的RNA拷贝。同时....
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致谢
桑德勒哮喘基础研究中心（SABRE）
桑德勒基金会
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM HEK 293T 细胞 青霉素-链霉素 谷氨酰胺 磷酸盐缓冲液 FBS | Invitrogen | ||
| FuGENE 6 转染试剂 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche Group | ||
| 漂白剂 | Clorox | ||
| 10 cm 细胞培养皿 96 孔细胞培养板 | Falcon BD | 353003 | |
| 多通道移液器 | Rainin | ||
| 带滤芯移液器吸头 | Rainin | ||
| 1.5 ml Eppendorf 管 注射器 滤膜（0.45-μm） | Eppendorf | ||
| 超速离心管 | Beckman Coulter Inc. | ||
| 含 5% CO2 的组织培养孵育箱 | Coulter | ||
| Beckman SW41T.I 转子 | |||
| Beckman 超速离心机 | Beckman Coulter Inc. | ||
| 荧光显微镜 | Coulter | ||
| FACS Array | Beckman Coulter Inc. |
参考文献
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
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