慢病毒生产

摘要

制备慢病毒时，将DNA载体转染至人293细胞中。收集并浓缩上清液后，通过流式细胞仪检测荧光表达来测定病毒滴度。

摘要

RNA干扰（RNAi）是活细胞中一种基因沉默系统。在RNAi过程中，与短干扰RNA（siRNA）序列同源的基因在转录后水平被沉默。短发夹RNA（shRNA）是siRNA的前体，可通过慢病毒进行表达，从而实现多种细胞类型的RNAi。慢病毒（如人类免疫缺陷病毒）能够感染分裂和非分裂细胞。本文将描述一种慢病毒包装的实验流程。包装是指从DNA载体中制备具有感染能力的病毒颗粒。慢病毒载体生产系统采用“分拆”策略，即将天然病毒基因组拆分为多个独立的辅助质粒。将不同的病毒元件分别构建在四个独立载体中，可显著降低因慢病毒基因组意外重组而产生具有复制能力病毒的风险。在此方法中，将含有目标shRNA的载体以及三个包装载体（p-VSVG、pRSV、pMDL）瞬时转染至人293细胞中。转染后至少培养48小时，收集含病毒的上清液并进行浓缩。最后，通过流式细胞仪检测报告基因（荧光）的表达水平，测定病毒滴度。 RNA干扰, 慢病毒包装, shRNA, siRNA, 基因沉默, 293细胞, 病毒滴度, 流式细胞术, 转染, 基因表达调控

方案

第1部分：转染HEK 293细胞以生产慢病毒

*转染前24小时，将2.5 × 10⁶个细胞接种于10 cm培养皿中，使次日细胞融合度达到50–70%。

1. 首先准备用于后续转染细胞以产生病毒的DNA。在1.5 ml离心管中，用移液器加入FuGENE 6 Transfection Reagent Roche——一种可促进细胞摄取DNA的脂质转染试剂，并进行稀释。 30μl 将 FuGENE 6 加入 600 μl 无血清培养基（SFDMEM）中。加入时注意避免 FuGENE 接触离心管管壁。将 FuGENE 与 SFDMEM 混合后，室温孵育 5 分钟。
2. 在管盖中混合 4 μg 带有慢病毒质粒的 4 μg 每个 3^rd 生成病毒包装载体（pMDL、pRSV 和 pVSV-G）。慢病毒质粒包含病毒在感染每个细胞时将其插入宿主基因组的DNA，而包装载体则包含生成慢病毒所需的所有其他蛋白质的基因。
3. 盖上管盖，通过反复倒置试管混匀。
4. 室温孵育15-20分钟。
5. 将管中的全部内容用移液器转移至293细胞培养板中。通过轻轻前后倾斜培养板混匀。
6. 将细胞放回培养箱，使病毒生产持续 48–96 小时后再进行收获。
7. 孵育期间，293细胞从慢病毒质粒中转录目的DNA，产生慢病毒构建体的RNA拷贝。同时，细胞也转录并翻译包装载体中的基因，生成病毒蛋白。这些蛋白进而组装成含有慢病毒构建体RNA版本的病毒颗粒，该病毒将通过逆转录将其RNA基因组整合到所感染细胞的基因组中。

第二部分：慢病毒收获

1. 孵育结束后，从培养箱中取出细胞，使用一次性10 ml注射器移除上清液（其中含有病毒），上清液体积约为10 ml。
2. 在注射器前端连接一个0.45 μm的针头滤器，将病毒液过滤至Beckman超速离心管中。该滤器仅允许病毒通过，而阻止细胞通过。
3. 在丢弃前，将所有产毒细胞、培养板、注射器和滤器置于10%次氯酸钠溶液中浸泡45分钟。

第3部分：通过超速离心法浓缩慢病毒

1. 将离心管装入SW-41Ti或SW-28转子吊桶中。
2. 使用无血清DMEM平衡所有含病毒的离心管，使其重量差异在0.2 g以内。
3. 密封转子吊桶，并在将转子放入超速离心机之前将其挂到转子上。
4. 在4°C条件下，使用SW-41Ti转子以25,000 rpm或使用SW-28转子以24,000 rpm在超速离心机中离心病毒90分钟。
5. 在组织培养生物安全柜中，将离心管倒置，使上清液倒入含有10%次氯酸钠的容器中。
6. 使用Kimwipe纸巾吸除沉淀周围多余的液体，并将离心管倒置放置于合适的架子上，时间不超过五分钟。
7. 为重悬病毒沉淀，使用滤芯吸头向离心管中加入100 μL无菌PBS，然后上下吹打约20次。
8. 将病毒在4°C下静置过夜以完成重悬。病毒制剂可在4°C保存约1周，在-80°C可保存长达一年。丢弃前请务必用10%次氯酸钠处理所有空管。
9. 若计划使用病毒制剂超过1周，应将其分装为最小体积，每份5–20 μL用于后续实验，另分装1份3–5 μL用于滴度测定。将分装样品在-80°C冷冻保存。

第4部分：使用流式细胞术进行慢病毒滴度测定

1. 下一步是通过流式细胞术测定病毒滴度。该方法仅适用于慢病毒质粒中含有荧光报告基因的情况。其原理在于，当病毒感染细胞时，会将慢病毒质粒DNA整合到该细胞的基因组中。被感染的细胞随后会转录并翻译您在慢病毒质粒中插入的基因；如果您插入了荧光报告基因，则被感染的细胞将发出荧光。荧光水平反映了病毒的感染能力，即滴度。
2. 对于每种待测定滴度的病毒储备液，将 3 μl 浓缩病毒加入 1.5 ml 完全培养基（DMEM、青霉素-链霉素、谷氨酰胺、FBS）中进行稀释。
3. 在 96 孔板的一整行中的第 1 至第 6 孔中进行如下系列稀释：向所有 6 个孔中各加入 100 μl 完全 DMEM 培养基。向第一孔加入 100 μl 不含病毒的培养基（作为未染色对照），向第二孔加入 100 μl 稀释后的病毒液（相当于 1 μl 未稀释病毒），向第三孔加入 100 μl 第二孔的混合液，向第四孔加入 100 μl 第三孔的混合液，向第五孔加入 100 μl 第四孔的混合液，向第六孔加入 100 μl 第五孔的混合液。最后从第六孔中取出 100 μl 弃入含漂白剂的容器中。由此完成系列稀释，使每个孔中的病毒体积为前一个孔的一半。
4. 将所有孔中的总体积补至 200 μl。注意：此处提供的稀释比例仅为建议值，适用于大多数浓缩病毒的滴度测定。若病毒滴度较低或未浓缩，可能需要调整稀释比例。
5. 将未使用的稀释病毒液用 10% 漂白剂处理 45 分钟后，再弃入生物危害废物容器中。
6. 向每个 6 个孔中加入约 15,000 个健康且处于活跃分裂状态的 293 细胞。一块 96 孔板可用于同时测定 16 种病毒制备物的滴度。
7. 将细胞放回 37°C、含 5% CO₂ 的培养箱中，继续培养至少 48 小时以完成感染过程。
8. 培养结束后，使用流式细胞仪检测细胞中报告基因的表达情况（在本实验中为荧光信号）。通过每孔中荧光阳性细胞所占百分比来定量病毒颗粒的数量。

使用以下公式计算每毫升中的感染单位数：

第5部分：代表性结果：

转染后经过48小时的孵育期，293细胞培养板中应有约90%的细胞呈现荧光。荧光细胞比例较高表明产生病毒的细胞比例也较高。

离心后，重新悬浮时病毒沉淀几乎不可见。这是正常现象，因为沉淀物透明且非常微小。

在解读流式细胞仪结果时，应注意只有当被感染（荧光）的细胞每细胞接受的病毒整合不超过一个时，才能获得准确的滴度计算结果。为确保满足此条件，应使用具有 < 用于计算的感染率为15%。感染率较高的细胞可能每细胞已接收多个病毒整合子。步骤2中建议的稀释梯度应产生多个处于该感染率范围内的样本。理想情况下，应使用多个样本生成滴定曲线（线性直线），并据此计算最终滴度；但必要时也可使用单个样本进行滴度计算。可预期的滴度为1.0 x 10⁷ TU/ml，用于未浓缩病毒，以及 1.0 × 10⁸ 浓缩病毒的滴度单位为 TU/ml。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM HEK 293T 细胞 青霉素-链霉素 谷氨酰胺 磷酸盐缓冲液 FBS	Invitrogen
FuGENE 6 转染试剂 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
漂白剂	Clorox
10 cm 细胞培养皿 96 孔细胞培养板	Falcon BD	353003
多通道移液器	Rainin
带滤芯移液器吸头	Rainin
1.5 ml Eppendorf 管 注射器 滤膜（0.45-μm）	Eppendorf
超速离心管	Beckman Coulter Inc.
含 5% CO2 的组织培养孵育箱	Coulter
Beckman SW41T.I 转子
Beckman 超速离心机	Beckman Coulter Inc.
荧光显微镜	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.