利用电喷雾电离质谱法对酵母脂质组进行定量分析

摘要

我们介绍一种新的定量脂质组学方法，利用全扫描电喷雾电离质谱法（ESI/MS）鉴定酵母中的多种脂质种类。该方法在分辨各类脂质分子形式的能力、灵敏度和检测速度方面均优于目前可用的脂质鉴定与定量方法。

摘要

脂质是生物大分子的主要类别之一，在膜动力学、能量储存和信号传导中发挥着重要作用^1-4. 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，一种基因组已注释、脂质组极为简单且可进行遗传和生化操作的单细胞真核生物，是研究多细胞真核生物中各类脂质分子生物学功能的宝贵模型^2,3,5.S. cerevisiae具有10大类脂质，其碳链长度主要为16或18个碳原子，且通常不含或含有一个不饱和键^6,7. 用于脂质鉴定与定量的现有方法——例如高效液相色谱法、薄层色谱法、荧光显微镜技术，以及气相色谱联用质谱法（MS）——虽然已较为成熟，但存在灵敏度低、难以充分分离脂质的不同分子形式、分析前需对脂质进行衍生化处理，或耗时较长等局限性。本文详细描述了我们采用全扫描电喷雾电离质谱法（survey-scan ESI/MS）来鉴定和定量酵母细胞中全部脂质组的实验方法，以克服上述固有缺陷。该方法无需对从酵母细胞中提取的复杂脂质混合物进行色谱分离，从而显著加快数据采集过程。本方法可在低至 g/ml 的浓度下实现脂质的鉴定与定量，已成功应用于完整酵母细胞及其纯化细胞器的脂质组分析。采用该脂质分析方法时，从完整酵母细胞中提取脂质需时两到三小时。在配备纳米电喷雾离子源的Q-TOF质谱仪上，每份提取并干燥后的脂质样品仅需五到十分钟即可完成检测。

方案

材料与方法

1. 酵母菌株及培养条件
   野生型菌株 BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) 在 YEPD 富集培养基（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖）中培养。细胞在 30°C 下于锥形瓶中以 200 rpm 振荡培养，培养瓶体积与培养基体积之比为 5:1。
2. 用于脂质提取的酵母细胞储存
   
   1. 通过在 3000 × g 离心 5 分钟收集 50 ml 培养物中的细胞。
   2. 用预冷的水洗涤两次。
      1. 将沉淀重悬于 25 ml 冰冷水中
      2. 在离心机中以 3000 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀
   3. 将沉淀重悬并转移至离心管中
   4. 以 16,000 × g 离心 2 分钟收集沉淀，弃去上清液后于 -80°C 冻存 备用。（我们使用放置在 -80°C 冰箱中的异丙醇烧杯，也可使用液氮）
3. 试剂
   生物技术级氯仿和甲醇购自 Sigma-Aldrich。游离脂肪酸和三酰甘油购自 Larodan（Malmo，瑞典）。各种磷脂——包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和心磷脂——购自 Avanti Polar Lipid（Alabaster，AL，美国）。带聚四氟乙烯衬里盖的高速玻璃离心管购自 Fisher。

脂质提取

这是对 Bligh 和 Dyer 所描述方案的改进⁸所有提取脂质的操作均应使用玻璃移液管或注射器；塑料制品若接触氯仿会产生较强的背景信号。氯仿-甲醇-水的体积比为1:2:0.8，具体体积无需精确，只要保持该比例即可。₂在步骤3中为O，氯仿-MeOH-H的比例为2:2:1.8₂在第7步中，O是保守的。

1. 将冻存的细胞重悬于 1.6 ml 冰冷的蒸馏 H₂O 中。
2. 将 1.6 ml 细胞悬液转移至高速玻璃离心管中。
3. 向细胞悬液中加入 6 ml 氯仿与甲醇（1:2）混合液以及 0.8 ml 玻璃珠。
4. 用涡旋振荡器将含玻璃珠的细胞悬液振荡两次，每次 1 分钟。
5. 加入 2 ml 氯仿，轻轻混匀。
6. 室温孵育 5 分钟，期间偶尔混匀。
7. 加入 2 ml 蒸馏 H₂O，轻轻混匀。
8. 室温孵育 5 分钟，期间偶尔混匀。
9. 在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。
10. 将全部液相转移至新的高速玻璃离心管中。
11. 向第 9 步得到的细胞沉淀中加入 3.2 ml 氯仿。
12. 涡旋振荡两次，每次 1 分钟。
13. 在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。
14. 将上清液加入第 10 步所得的液相中。
15. 在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。
16. 弃去上层（水相），将下层（有机相）转移至新的高速玻璃离心管中。
17. 在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。
18. 将全部上清液转移至玻璃样品瓶中，并在氮气下吹干。
19. 用 500 μl 氯仿溶解脂质薄膜，并于 -20°C 保存。

质谱法分析脂质

应按照表1预先配制氯仿中的脂质标准品储备混合液，以及含有0.1%（v/v）氢氧化铵的甲醇-氯仿（1:1）储备溶液。

1. 注射前，将10 μl样品与表1提供的脂质标准混合物10 μl混合，溶于200 μl的氯仿:甲醇（1:1）溶液中，其中含0.1% NH₄OH。
   • 可根据需要调整标准品与样品的比例。
2. 使用配备纳米电喷雾离子源的Micromass Q-TOF 2质谱仪，以1 μl/min的流速分离脂质。
   • 具体仪器参数因设备而异。表2列出了配备纳米电喷雾离子源的Micromass Q-ToF 2质谱仪（Waters, Milford, MA, USA）的设置参数。尽管我们利用了Q-TOF型质谱仪的高分辨率优势，但该类型仪器并非必需。
3. 采集质谱数据后，对谱图进行平滑处理、背景扣除和峰中心校正，然后将峰列表导出至Excel。随后将每类脂质的峰强度归一化至其对应的内标。根据具体应用需求，可能还需进行进一步的后期处理，如去同位素峰和去卷积。

表1. 内标脂质、其在标准混合物中的浓度以及用于分析的质谱模式。

脂质类别	标准链组成	标准物质质量	浓度 (μg/ml)	质谱模式
磷脂酸	14:0/14:0	591.40	100	负离子模式
磷脂酰乙醇胺	14:0/14:0	634.45	200	负离子模式
磷脂酰肌醇	不适用	不适用	不适用	负离子模式
磷脂酰丝氨酸	14:0/14:0	622.37	40	负离子模式
心磷脂	4×14:0	619.92	100	负离子模式
游离脂肪酸	19:0	297.28	100	负离子模式
磷脂酰胆碱	14:0/14:0	650.48	100	正离子模式
三酰甘油	13:0/13:0/13:0	698.63	200	正离子模式

表2. 配备纳米电喷雾源的Micromass Q-ToF 2（Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）仪器设置。

	流速	锥孔电压	毛细管电压	碰撞气体
正离子模式	1μl/min	-28 v	3.0 kv	10
负离子模式	1μl/min	30 v	-3.2 kv	10

讨论

该方法利用 readily available 且 inexpensive 的材料，可对酵母脂质组进行快速定量分析。该方法能够鉴定出酵母细胞中大多数脂质种类，但二酰基甘油、麦角固醇及其酯类除外；不过，若将氢氧化铵替换为氢氧化锂，则也可鉴定这些脂质。所述方法可实现低至 μg/ml 浓度的脂质鉴定与定量，浓度线性范围跨越 2 至 3 个数量级（具体取决于脂质种类）。尽管目前 commercially available 的磷脂酰肌醇标准品尚不可得，但可利用其他磷脂类标准品对这种磷脂的不同分子形式进行评估。