一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

摘要

我们描述了一个新的定量确定使用调查的扫描电喷雾电离质谱（ESI / MS）酵母大量的脂质物种lipidomics方法。这种方法超过目前可用的方法脂质识别和量化的能力来解决血脂，灵敏度和速度不同的分子形式。

摘要

脂质是生物分子的主要类别之一，并发挥重要作用膜动力学，能量存储，和信令

方案

材料和方法

1. 酵母菌株和生长条件。
   丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0）（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖） 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM"瓶体积/中等音量"5:1的比例。
2. 脂质提取的酵母细胞储存
   
   1. 文化是收获的细胞50毫升离心5分钟在3000 XG。
   2. 用冷水冲洗两次。
      1. 悬浮颗粒在25毫升冰水
      2. 在离心沉淀细胞，5分钟在3000 XG
   3. 悬浮颗粒和转移到Eppendorf管
   4. 球离心，16000 XG 2分钟，取出使用上清于-80 ° C，直到和冻结。 （我们使用异丙醇的烧杯中，也可以用液态氮保存在-80冷冻）
3. 试剂
   自Sigma - Aldrich生物技术级氯仿和甲醇。游离脂肪酸和甘油三酯均购自Larodan（瑞典马尔默）。获得各种种磷脂 - 包括磷脂，磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，并cardiolipins - 阿凡提极性脂（雪花石膏，AL，美国）。从费舍尔高速离心管玻璃与聚四氟乙烯内衬的盖子。

脂质提取

这是一个布莱和代尔⁸所述的协议的修改。提取血脂所有的操作，应使用玻璃移液管或注射器，塑料将创建一个大的背景信号，如果他们接触到，以氯仿。确切的卷是不是只要关键氯仿的比例为1:2:0.8 -甲醇-在第3步中的H ₂ O和2:2:1.8为氯仿-甲醇- _{H 2} O在第7步是保守的。

1. 冷冻细胞重悬在1.6毫升的冰冷的蒸馏水H _{2 O}
2. 1.6毫升细胞悬液转移到高速的玻璃离心管。
3. 加入6毫升氯仿和甲醇（1:2）混合和0.8毫升细胞悬液的玻璃珠。
4. 涡细胞悬液，用玻璃珠1分钟的2倍。
5. 加入2毫升氯仿，轻轻混匀。
6. 孵育5分钟室温搅拌偶尔。
7. 加入2毫升的蒸馏水H _{2 O，}轻轻混匀。
8. 孵育5分钟室温搅拌偶尔。
9. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
10. 整个液相收集到一个新的高速玻璃离心管。
11. 从第9步的细胞沉淀，加入3.2毫升氯仿。
12. 涡1分钟两次。
13. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
14. 从第10步液相添加上清。
15. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
16. 倒掉上层（水）相和较低的阶段（有机）转移到一个新的高速玻璃离心管。
17. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
18. 整个上清转移到一个玻璃小瓶，干燥的氮气保护下。
19. 脂质膜溶解于500μL氯仿和储存在-20 ° C

质谱分析血脂

血脂标准的股票组合中的氯仿应事先准备好的，按表1，以及原液的甲醇 - 氯仿（1:1）0.1％（V / V）氢氧化铵。

1. 注射前，结合10μL在表1提供的血脂标准混合样品10μL。在200μL1:1的氯仿:甲醇与0.1％NH ₄ OH。
   • 样本比例的标准是可以改变的需要。
2. 解决使用一个微团的Q - TOF质谱仪配备与1μL/ min的流速在纳米电源经营血脂。
   • 从仪器仪表精确的仪器参数会有所不同。一个微团配备一个纳米电源2 Q - TOF（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国）的设置，请参阅表2。虽然我们已采取的Q - TOF质谱仪的一个类型的高分辨率的优势，它不是一种强制性要求。
3. 收购后的质谱是平滑的，减去背景和中心，然后高峰列表导出到Excel。每个脂质类的峰值，然后归到他们的内部标准。根据不同的应用，它可能需要做进行进一步处理后deisotoping和反褶积等。

表1。内部血脂标准，其浓度标准的组合，并为他们的分析MS模式。

脂质类	标准链的构成	标准的质量	浓度（微克/毫升）	MS模式
磷脂酸	14:0 / 14:0	591.40	100	负面
磷脂酰乙醇胺	14:0 / 14:0	634.45	200	负面
磷脂	N / A	N / A	N / A	负面
磷脂	14:0 / 14:0	622.37	40	负面
心磷脂	4x14:0	619.92	100	负面
游离脂肪酸	19:0	297.28	100	负面
卵磷脂	14:0 / 14:0	650.48	100	积极的
甘油三酯	13:0 / 13:0 / 13:0	698.63	200	积极的

表2。一个微团Q - TOF 2（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国）的仪器设置配备纳米电源。

	流量	锥孔电压	毛细管电压	碰撞气体
正离子模式	1μl/min	-28 v	3.0 KV	10
负离子模式	1μl/min	30 V	-3.2 KV	10

讨论

这种方法使酵母lipidome使用现成的，廉价的材料的快速定量评估。该方法允许大部分diacylglycerols，ergosterols和ergosteryl酯的例外在酵母细胞中发现的脂质物种的鉴定，虽然这些脂质可取代氢氧化锂，氢氧化铵确定。所描述的方法可低至微克/毫升的浓度脂质识别和量化，与浓度的线性超过2〜3个数量级（脂质种而定）的蔓延。虽然市售磷酸肌醇的适当的标准，本磷脂不同的分子形式可以使用其他磷脂物种的标准进行评估。