制备人血小板裂解液（pHPL）作为无动物血清人干细胞培养的高效补充剂

摘要

人血小板裂解液是生长因子的丰富来源，也是细胞培养中一种高效的补充剂。本方案介绍了从富血小板血浆开始，通过多次冻融循环并去除血小板碎片，制备大量人血小板裂解液的过程。

摘要

血小板源性生长因子已被证明能有效刺激细胞增殖in vivo^1,2和in vitro. 这一效应已在经凝血酶激活的血小板作用下的间充质基质细胞（MSCs）、成纤维细胞和内皮集落形成细胞中被报道^3-5或通过冻融循环裂解^6-14在将血小板释放物加入细胞培养基之前。血小板源性生长因子的营养作用已在多项试验中用于组织工程和再生治疗的研究。^1,15-17效率的差异被认为至少部分是由于生长因子的个体浓度不同所致^18,19以及血小板制备方面目前缺乏标准化的操作规程。^15,16本方案提供了一种可行的操作流程，用于制备来源于40至50份单次献血所常规制备的富血小板血浆（PRP）的人源血小板裂解物（pHPL）。通过多次冻融循环，破坏血小板膜结构，从而高效释放生长因子至血浆中。最后，通过离心去除血小板碎片，以避免形成大量聚集体并清除潜在抗原。将pHPL应用于标准细胞培养体系，是推动在无动物蛋白系统中扩增细胞治疗产品的有前景工具。

方案

1. 起始材料

从通过细胞单采术制备或从血沉棕黄层获得的富血小板血浆（PRP）单位开始。

2. 无菌检查

为进行无菌检查，通过将液体转移至一个已连接的小袋（Baxter）中，从每单位PRP中取20 mL样品。通过热封断开此小袋。

3. PRP 样本的冷冻

制备后应立即在原始储存袋中将PRP单元冷冻至至少-20°C，无需进一步处理。

4. HPL 单位的解冻

当细菌检测结果为阴性时，将人血小板裂解物单位（现称为HPL单位）在37°C（水浴）条件下解冻，直至冰晶完全消失。切勿加热HPL。

5. HPL 单位的汇集

为制备标准化产品，至少取十到十五个解冻的HPL单位用于一个血小板裂解物混合池。将HPL袋依次连接至混合双联袋（MacoPharma），并将HPL转移至这两个袋中。通过热封断开空的HPL袋。混合两个袋中的内容物，获得3至4 L的混合人血小板裂解物（pHPL）。连接一个小袋（Baxter），取20 mL pHPL样品用于混合产品的无菌检....

讨论

在某些地区，富血小板血浆（PRP）可从白膜层中获取，而白膜层通常是经检测的献血血液在制备浓缩红细胞过程中产生的废弃副产品（图1）。理想情况下，PRP应立即用于后续pHPL的制备，因为在过期的血小板浓缩物中，由于血小板储存损伤及降解，生长因子的可用性可能降低²⁰。此外，建议采用血型O型的血小板与血型AB型的血浆配伍来制备PRP，以避免ABH抗原和同种凝集素可能产生的影响。迄今为止，细胞培养主要使用胎牛血清（FBS），但其存在异种免疫反应²¹以及传播已知和未知病原体的风险。尽管自体血清或无血清培养基等替代方案已被尝试，但在许多应用中尚未成功取代FBS²²。在既往研究中，我们比较了pHPL与FBS对间充质基质细胞扩增的影响，结果显示pHPL在细胞增殖方面具有更高的效率^7,8,23。Reinisch et. al.¹¹已证明在EGM-2培养基中添加pHPL、并在无动物血清条件下实现内皮祖细胞的分离和大规模扩增，该方法亦由Nicole A. Hofmann作为JoVE实验方案进一步展示。MSC和ECFC培养基制备的详细操.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双层袋 (2 x 3.5L)	MacoPharma	VDL 8000XQ	原用于腹水穿刺
50 mL 离心管	Falcon BD	2098
50 mL 移液管	Costar	4501
血浆袋 (600 mL)	Baxter International Inc.	R4R2021
无菌管路焊接仪	Terumo Medical Corp.	TSCD-II
焊接设备	Fresenius Kabi	Compo Seal
水浴锅
无菌剪刀
夹钳
离心机