制备人血小板裂解液（pHPL）作为无动物血清人干细胞培养的高效补充剂

摘要

人血小板裂解液是生长因子的丰富来源，也是细胞培养中一种高效的补充剂。本方案介绍了从富血小板血浆开始，通过多次冻融循环并去除血小板碎片，制备大量人血小板裂解液的过程。

摘要

血小板源性生长因子已被证明能有效刺激细胞增殖in vivo^1,2和in vitro. 这一效应已在经凝血酶激活的血小板作用下的间充质基质细胞（MSCs）、成纤维细胞和内皮集落形成细胞中被报道^3-5或通过冻融循环裂解^6-14在将血小板释放物加入细胞培养基之前。血小板源性生长因子的营养作用已在多项试验中用于组织工程和再生治疗的研究。^1,15-17效率的差异被认为至少部分是由于生长因子的个体浓度不同所致^18,19以及血小板制备方面目前缺乏标准化的操作规程。^15,16本方案提供了一种可行的操作流程，用于制备来源于40至50份单次献血所常规制备的富血小板血浆（PRP）的人源血小板裂解物（pHPL）。通过多次冻融循环，破坏血小板膜结构，从而高效释放生长因子至血浆中。最后，通过离心去除血小板碎片，以避免形成大量聚集体并清除潜在抗原。将pHPL应用于标准细胞培养体系，是推动在无动物蛋白系统中扩增细胞治疗产品的有前景工具。

方案

1. 起始材料

以通过细胞单采术制备或从白膜层获得的富血小板血浆（PRP）单位开始。

2. 无菌检查

为进行无菌检查，通过将液体转移至一个连接的小袋（Baxter）中，从每单位PRP中取20 mL样品。通过热封断开此小袋。

3. PRP 样本的冷冻

制备完成后，立即将PRP单元在原始储存袋中冷冻至至少-20°C，无需进一步处理。

4. HPL 单位的解冻

当细菌检测结果为阴性时，将人血小板裂解液单位（现称为HPL单位）在37°C（水浴）中解冻，直至冰状凝块消失。切勿对HPL进行加热。

5. HPL 单位的汇集

为制备标准化产品，至少取十到十五个解冻的HPL单位用于制备一池血小板裂解物。将HPL袋依次连接至汇集双联袋（MacoPharma），并将HPL转移至这两个袋中。通过热合断开空的HPL袋。混合两个袋中的内容物，获得3至4 L的汇集人血小板裂解物（pHPL）。连接一个小袋（Baxter），取20 mL pHPL样品用于检测汇集产品的无菌性。通过热合断开该小袋。

6. pHPL 的分装

分装pHPL，以获得适合后续处理的等分试样。将小袋（Baxter）连接到汇集双联袋（Macopharma），并将最多250 mL的液体转移至小储存袋（Baxter）中。通过热封断开已装满的袋子。

7. pHPL 分装样品的再次冷冻

通过额外的冻融步骤提高血小板碎片化的速率以及释放的生长因子的量。将分装好的小袋pHPL再次于至少-20°C条件下冷冻。

8. pHPL 分装样品的再次解冻与分装

在37°C（水浴）中解冻pHPL袋。使用无菌剪刀剪开袋子的管路，将内容物转移至50 mL离心管（Falcons BD）中，并将pHPL倒入离心管内。此步骤需在超净工作台中进行，以避免细菌或真菌污染。

9. 去除血小板碎片

由于血小板碎片容易聚集并可能引起同种免疫反应，因此需从pHPL中去除。将pHPL小瓶在4,000g离心15分钟（4°C）。在超净工作台中，用移液器将上清液转移至最终储存小瓶（BD Falcon）中，并弃去血小板沉淀，以避免细胞培养中出现碎片。

10. pHPL 的储存

将50 mL pHPL小瓶中的样品再次冷冻至至少-20°C，并保存以供实验使用。

11. pHPL 在细胞培养中的应用

最初向培养基中添加不含防腐剂的肝素，以避免凝胶形成。在37°C下解冻一份无菌人血小板裂解液（pHPL） aliquot，并通过添加8–10%补充至培养基中。

培养基

MSC培养基：

取500 mL a-MEM，加入56 mL解冻后的pHPL（详见参考文献1）和不含防腐剂的肝素（2 IU/mL，即224 μL储存液），使pHPL终浓度为10%（肝素可防止血浆中纤维蛋白原聚集导致培养基凝固）。此外，加入青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 μg/mL）溶液和2 mM L-谷氨酰胺（均来自Sigma）。

使用20 μm孔径的真空滤膜（Millipore）过滤培养基。妥善标记瓶子（内容物、日期）。

ECFC 培养基：

取一瓶（500 mL）EBM 培养基，向基础培养基中加入细胞因子分装液、56 mL pHPL、不含防腐剂的肝素（10 IU/mL，即 1120 μL 原液）、青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 μg/mL）溶液以及 2 mM L-谷氨酰胺，然后使用孔径为 20 μm 的真空滤器（Millipore）过滤。妥善标记瓶身（注明内容物和日期）。

图1：从当地血库或其他授权机构提供的全血捐献中制备富血小板血浆。血液经离心后可分离为血浆、白膜层和红细胞。可将4个O型血的白膜层单位与1个AB型血的血浆混合后进行离心，以获得富含血小板的血浆。一份质量合格的富血小板血浆约300 mL，其浓度应达到每毫升含1×10⁹个血小板，或总量达3×10¹¹个血小板。

讨论

在某些地区，富血小板血浆（PRP）可从白膜层中获取，而白膜层通常是经检测的献血血液在制备浓缩红细胞过程中产生的废弃副产品（图1）。理想情况下，PRP应立即用于后续pHPL的制备，因为在过期的血小板浓缩物中，由于血小板储存损伤及降解，生长因子的可用性可能降低²⁰。此外，建议采用血型O型的血小板与血型AB型的血浆配伍来制备PRP，以避免ABH抗原和同种凝集素可能产生的影响。迄今为止，细胞培养主要使用胎牛血清（FBS），但其存在异种免疫反应²¹以及传播已知和未知病原体的风险。尽管自体血清或无血清培养基等替代方案已被尝试，但在许多应用中尚未成功取代FBS²²。在既往研究中，我们比较了pHPL与FBS对间充质基质细胞扩增的影响，结果显示pHPL在细胞增殖方面具有更高的效率^7,8,23。Reinisch et. al.¹¹已证明在EGM-2培养基中添加pHPL、并在无动物血清条件下实现内皮祖细胞的分离和大规模扩增，该方法亦由Nicole A. Hofmann作为JoVE实验方案进一步展示。MSC和ECFC培养基制备的详细操...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双层袋 (2 x 3.5L)	MacoPharma	VDL 8000XQ	原用于腹水穿刺
50 mL 离心管	Falcon BD	2098
50 mL 移液管	Costar	4501
血浆袋 (600 mL)	Baxter International Inc.	R4R2021
无菌管路焊接仪	Terumo Medical Corp.	TSCD-II
焊接设备	Fresenius Kabi	Compo Seal
水浴锅
无菌剪刀
夹钳
离心机